Автореферат (1150275), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В третьей покровной пластинке В в центречерной части было изготовлено отверстие (диаметр 10 мм, глубина 10 мм) для окошкадетектора фотоумножительной трубки (Рисунок 9.8). Поверхности всех пластинок и отверстийбыли тщательно отполированы. После этого внутрь прямого канала, соединяющего коническоеотверстие и нижнюю грань пластинки, вклеивали кварцевый капилляр с квадратным сечением(внешний размер 1,5 × 1,5 мм; внутренний размер 0,68 × 0,68 мм) (Рисунок 9.9).
Пластинки Аи Б соединяли, помещали под пресс и выдерживали при температуре 135°C (Рисунок 9.10).Пластинки В служила для фиксации светофильтра в прямоугольном углублении пластинки А cодной стороны и размещения фотоумножительной трубки с другой. Пластинку В соединяли сосклеенными пластинками А и Б при помощи шурупов (Рисунок 9.11).
Таким образом, в верхнейчасти устройства располагалась реакционная емкость, при этом прозрачный ПММАобеспечивал возможность контроля протекающих в ней процессов; в нижней черной частимезофлюидного устройства располагался оптический канал и система детектирования.Выбранный черный полимерный материал устранял эффекты рассеяния излучения отисточников света.Рисунок 9. Схема изготовления мезофлюидного устройства циклического инжекционногофлуориметрического анализа.
1-11 – этапы изготовления мезофлюидного устройства. А, Б, B –пластинки из ПММА.Топология мезофлюидного устройства для миниатюризации циклическогоинжекционного флуориметрического анализа (Рисунок 10) включала в себя реакционнуюемкость (1) – вертикальный цилиндрический канал с конусообразным окончанием. Такаяформа реакционной емкости позволяла проводить аналитические реакции при перемешиваниирастворов потоком газа. Реакционная емкость соединена с атмосферой с одной стороны, сдругой с оптическим каналом. Канал для ввода растворов (2) и канал подачи потока газа (3)были соединены с конусообразным окончанием реакционной емкости.
Внутри оптического14канала (4) размещался прямоугольный кварцевый капилляр, непосредственно в котором иосуществлялось детектирование.Для увеличения интенсивности возбуждающего излучения в мезофлюидноеустройство ЦИА встраивали два одинаковых светодиода, расположенных на одной оси, спротивоположных сторон оптического канала. Детектором служила фотоумножительнаятрубка (Hamamatsu Photonics, H10722-20), перед которой располагали светофильтр дляпредотвращения попадания излучения от источников света в детектор. Детектор располагалсяпод углом 90 градусов к источникам возбуждающего излучения.Рисунок 10.
Топология мезофлюидного устройства дляминиатюризациициклическогоинжекционногофлуориметрического анализа: 1 – реакционная емкость; 2 –канал для ввода растворов; 3 – канал для подачи газа; 4 –оптический канал с кварцевым капилляром внутри; 5 –окошко для фотоумножительной трубки; 6 – светофильтр;7 – сброс газовой фазы; 8 – сброс растворов; 9, 10 –светодиоды.Следует отметить, что был изготовлен отдельный канал для подачи газа напрямую вреакционную емкость. Такая конструкция позволяет осуществлять перемешивание растворовсразу после их поступления в реакционную емкость, что приводит к сокращению временианализа по сравнению с мезофлюидным устройством ЦИА с фотометрическимдетектированием, в котором используется единый канал для подачи растворов и потока газа вреакционную емкость. Однако, топология мезофлюидного устройства с фотометрическимдетектированием позволяет регулировать длину оптического пути и соответственноувеличивать чувствительность.Определение куркумина.
Аналитические возможности изготовленного устройства былиподтверждены на примере проточного флуориметрического определения куркумина пореакции с новым реагентом 4-(2,3,3-триметил-3H-индолий-1-ил)бутан-1-сульфонатом (ТИБС).ТИБС является производным индолеина, а по структуре представляет собой внутреннюю соль.Для определения куркумина ранее было предложено использовать комплекс европия стриптофаном (Wang F., Huang W. Determination of curcumin by its quenching effect on thefluorescence of Eu3+–tryptophan complex // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis.
2007.V. 4. P. 393–398). В основе определения лежит эффект тушения флуоресценции комплекса вприсутствии куркумина. Известная реакция обеспечивает высокую чувствительностьопределения куркумина (предел обнаружения – 0,9 нМ), однако является кинетическизамедленной (время реакции – 15 минут). Установлено, что интенсивность флуоресценцииТИБС при добавлении куркумина и постоянном перемешивании растворов изменяетсямгновенно и эффект тушения зависит от концентрации аналита. Обнаруженный эффект можетсущественно сократить время анализа по сравнению с известной флуориметрической реакцией.Были изучены флуоресцентные свойства нового реагента.
Измеряли спектрыфлуоресценции при возбуждении на длинах волн 280 нм и 317 нм в диапазоне 290-550 нм и327-550 нм соответственно. При увеличении концентрации реагента до 0,1 мМ в спектрахвозбуждения наблюдали выраженный максимум при 280 нм (Рисунок 11). Однако, приувеличении концентрации реагента до 0,4 мМ, максимум в спектрах возбуждения сдвигался с15280 нм до 317 нм и в то же время интенсивность сигнала увеличивалась. Максимальнуюинтенсивность флуоресценции наблюдали при концентрации реагента равной 0,8 мМ и длиневолны возбуждения – 317 нм (Рисунок 12). При этом максимум интенсивности в спектрефлуоресценции соответствует длине волны 378 нм.
Дальнейшее увеличение концентрацииреагента приводит к концентрационному тушению.Было установлено, что интенсивность флуоресценции раствора реагента увеличиваетсяв щелочной среде. В присутствии 2 мМ гидроксида натрия наблюдается максимальнаяинтенсивность флуоресценции (Рисунок 13).Рисунок 11. Спектры возбуждения (а) и флуоресценции (б) водных растворов ТИБС.Рисунок 12. Зависимость интенсивности Рисунок 13. Зависимость интенсивностифлуоресценции от концентрации ТИБС флуоресценции от концентрации NaOH(λex=317 нм, λem=378 нм).(C(ТИБС) = 0,8 мM, λex=317 нм, λem=378 нм).Согласно данным ЯМР-спектроскопии в щелочной среде наблюдали образование двухформ реагента (в соотношении 0,7:1,0 (II / III), которые существуют в равновесии с исходнойформой 4-(2,3,3-триметил-3H-индолий-1-ил)бутан-1-сульфоната (I):16При увеличении концентрации реагента (I), равновесие сдвигается в сторонуобразования формы (III), что также подтверждается данными ЯМР-спектроскопии.
Сдвигравновесия в сторону образования формы (III) в щелочной среде приводит к сдвигу максимумав спектрах возбуждения с 280 до 317 нм. Сдвиг максимума в видимую область может бытьобъяснен структурными изменениями в молекуле реагента, а именно, увеличениемсопряженной системы за счет депротонирования метильной группы в положении 2 (Форма III)в щелочной среде.
Сопряженная система структуры (III) состоит из бензольного кольца,неподеленной пары электронов на атоме азота и двойной связи (C=C) при атоме углерода вположении 2. Увеличение сопряжения системы приводит не только к сдвигу максимума вспектре возбуждения, но и к увеличению интенсивности флуоресценции (почти на 25 % посравнению с водным раствором исходной формы реагента). Сопряженная система формы (II)состоит из бензольного кольца и неподеленной пары электронов на атоме азота. Сопряженнаясистема формы (II) меньше, чем у формы (III), поэтому интенсивность флуоресценции ниже имаксимум в спектре возбуждения соответствует 280 нм.
Доказательством взаимодействиякуркумина с формой (III) можно считать данные, полученные методом спектрофлуориметрии.При добавлении куркумина к раствору ТИБС наблюдается тушение флуоресценции и непроисходит сдвига в спектре возбуждения до 280 нм, что свидетельствует о сдвиге равновесияв сторону образования именно формы (III).Для циклического инжекционного флуориметрического определения куркумина быларазработана новая аэрогидравлическая схема, включающая мезофлюидное устройство(Рисунок 14). В соответствии с этой схемой, при помощи шприцевого насоса (1) черезмногоходовой кран-переключатель (2) в удерживающий канал (3) последовательно отбирали10 мкл 0,8 мМ раствора ТИБС, 10 мкл раствора 2 мМ гидроксида натрия и 10 мкл растворакуркумина.
Из удерживающего канала (3) растворы перекачивали в реакционную емкостьмезофлюидного устройства (4) при выключенных перистальтических насосах (6 и 7). Черезканал (5) подавали поток азота напрямую в реакционную емкость при помощиперистальтического насоса (6) со скоростью 450 мкл/мин в течение 30 секунд. Послезавершения перемешивания насос (6) останавливали и раствор перемещали из реакционнойемкости в кварцевый капилляр оптического канала при помощи перистальтического насоса (7).Измерение интенсивности флуоресценции проводили в условиях остановленного потока. Наследующем этапе все коммуникации системы промывали дистиллированной водой.
Измерениеаналитического сигнала фонового раствора проводили согласно вышеописанному алгоритму,однако, вместо раствора пробы подавали дистиллированную воду.Рисунок 14. Аэрогидравлическаясхема для определения куркумина:1 – шприцевой насос; 2 –многоходовой кран-переключатель; 3 –удерживающий канал; 4 – мезофлюидное устройство; 5 – канал дляподачи азота; 6, 7 – перистальтические насосы; 8 – детектор.Разработанная методика была апробирована при определении куркумина вбиологически активных добавках. В качестве референтного использовали метод ВЭЖХ.Результаты, полученные по разработанной и референтной методикам, сравнивали при помощиF- и t-тестов (Таблица 5).
Полученные F-значения ≤ 6,39 указывают на незначительное различие17в величинах стандартных отклонений, а t-значения ≤ 2,31 указывают на отсутствиестатистически значимого различия между результатами, полученными по двум методикам.Таблица 5. Результаты определения куркумина в биологически активных добавках(n1 = 5, n2 = 5, P = 0,95).ПробаСертифициНайдено, гF-тест t-тестрованноеМезофлюидноеВЭЖХсодержание, устройство ЦИАгКуркумин0,650,646±0,0620,648±0,0531,350,89«Now foods»Турмерик0,500,480±0,0590,482±0,0561,860,91«Puritan’s Pride»Премиум турмерик0,500,495±0,0610,497±0,0541,401,82«Best Herb»Аналитические характеристики разработанной методики представлены в таблице 6.Впервые разработана проточная методика для определения куркумина.
Разработаннаяметодика позволяет проводить экспрессное, автоматизированное флуориметрическоеопределение куркумина. Мезофлюидное устройство ЦИА позволило сократить расходреагентов и время анализа за счет совмещения процессов образования аналитической формы идетектирования в одном устройстве.Таблица 6. Аналитические характеристики циклической инжекционной флуориметрическойметодики определения куркумина.ХарактеристикиУстановленное значениеОбъем раствора ТИБС, мкл10Объем пробы, мкл10Объем раствора NaOH, мкл10Суммарный расход реагентов на один анализ, мкл30Предел обнаружения, µM0,3Диапазон определяемых концентраций, µM1 – 10Коэффициент корреляции0,982СКО (n=5), %5,0Производительность, проб/час24Заключение1. Разработаны мезофлюидные устройства для миниатюризации циклическогоинжекционного фотометрического и флуориметрического анализа, которые позволяютсократить практически в 20 раз расход пробы и растворов реагентов по сравнению страдиционной схемой ЦИА.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
