Диссертация (1150176), страница 17

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 17)

К сожалению, поверхностнаяреология и эллипсометрия, используемые в данной работе, не позволяют выявить деталиподобных переходов в поверхностном слое. Однако можно заключить, что присовместном действии ГХГ и ПСС молекула лизоцима становится более гибкой испособна образовывать петли и хвосты в поверхностном слое.Изменения структуры адсорбционного слоя под действием ПСС не приводят кзаметным изменениям кинетических зависимостей поверхностного натяжения (рис.

42).Поверхностное натяжение растворов гибких макромолекул определяется локальнойконцентрацией сегментов в ближней области поверхностного слоя. Следовательно,данные, представленные на рис. 42, позволяют сделать вывод о том, что основныеизменения структуры происходят в дальней области поверхностного слоя, аконцентрация относительно гидрофобных аминокислотных остатков в ближней областиповерхностного слоя почти не зависит от концентрации ПСС в объеме раствора истепени разрушения глобулярной структуры.99100r , мН/м7550250050100150200250300t, минРис. 40. Кинетические зависимости действительной части динамической поверхностнойупругости растворов смеси лизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7, концентрации белка 3,5*10 6М, концентрации ГХГ 3М и концентрациях ПСС 0 (квадраты), 2*10-5 (круги), 2*10-4(треугольники), 2*10-3 (звезды), 2*10-2 мг/мл (снежинки).Рис.41.Схемавзаимодействиямеждулизоцим/ПСС/ГХГ и в поверхностном слое.100компонентамивобъемераствора75 , мН/м70656055050100150200250300t, минРис.

42. Кинетические зависимости динамического поверхностного натяжениярастворов лизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7 и концентрациях ГХГ 3М, лизоцима 3,5*10-6М,ПСС 0 (квадраты), 2*10-5 (круги), 2*10-4 (треугольники), 2*10-2 мг/мл (снежинки).С другой стороны, результаты, представленные на рис. 40 и 42, подтверждаютвысокуючувствительностьконформационнымпереходамдинамическойнаграницеповерхностнойразделафаз.упругостикЧувствительностьповерхностного натяжения к подобным изменения оказывается значительно ниже.Зависимостидинамическойповерхностнойупругостирастворовлизоцим/ПСС/ГХГ от поверхностного давления показывают, что максимальноезначение поверхностной упругости уменьшается с увеличением концентрации ПСС(рис. 43).

Поверхностное давление в области максимума поверхностной упругости принизкой концентрации ПСС, равное примерно 15 мН/м, совпадает с характеристическимповерхностным давлением для растворов этого белка, соответствующем образованиюпетель и хвостов в поверхностном слое под действием денатурантов различнойхимической природы [26,205]. В отличие от результатов для растворов без ГХГ, данныена рис. 43 указывают на сильные изменения структуры поверхностного слоя, как и вслучае растворов гибких амфифильных полимеров связанные с вытеснением отдельныхучастков макромолекул в дальнюю область.Эллипсометрические данные также указывают на сильные различия структурыадсорбционного слоя для растворов лизоцим/ПСС с добавлением и без добавления ГХГ101(рис.

44). Скорость адсорбции оказывается значительно выше для растворовлизоцим/ПСС/ГХГ, что связано с более высокой ионной силой растворов. Более важноеразличие состоит в том, что ∆surf и, следовательно, величина адсорбции возрастают сростом концентрации ПСС. Этот результат согласуется предположением о полномразворачивании глобул лизоцима под действием смеси ПСС и ГХГ, приводящем кобразованию дальней области поверхностного слоя и увеличению адсорбции. Вероятно,отдельные участки ПСС, взаимодействующие с развернутым лизоцимом, также могутпроникать в поверхностный слой и вносить вклад в увеличение ∆surf.Несмотря на то, что поверхностные свойства растворов лизоцим/ПСС/ГХГ илизоцим/ПСС сильно различаются, характер агрегации в объеме раствора оказываетсяблизким (рис. 45).

Добавление ГХГ к растворам лизоцима вызывает увеличениесреднего радиуса глобул с 2 до 4 нм вследствие их частичного разворачивания (рис. 45).100r , мН/м75502500510 , мН/м1520Рис. 43. Зависимости действительной части динамической поверхностной упругости отповерхностного давления растворов лизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7 и концентрациях ГХГ3М, лизоцима 3,5*10-6М, ПСС 0 (квадраты), 2*10-5 (круги), 2*10-4 (треугольники), 2*10-2мг/мл (снежинки).1025surf , град.432100200004000060000t, с.Рис. 44. Кинетические зависимости эллипсометрического угла ∆ растворов смесейлизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7 и концентрациях ГХГ 3М, лизоцима 3,5*10-6М, ПСС 0Интенсивность, произвольные единицы(квадраты), 2*10-4 (круги), 2*10-3 (треугольники), 2*10-2мг/мл (звездочки).3025201510500,1110100100010000d, нмРис. 45. Зависимость интенсивности рассеяния от размера частиц для растворов смесилизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7.

Концентрации ПСС: 0 (толстая линия), 2*10-5 мг/мл(тонкая линия), 1*10-1 мг/мл (штрихи).103Разрушение третичной структуры белка приводит к образованию крупныхагрегатов при увеличении концентрации ПСС. Даже в случае, когда концентрацияполиэлектролита составляет всего 2*10-5 мг/мл, пик интенсивности рассеянного света,соответствующий глобулам лизоцима, пропадает. В отличие от растворов лизоцим/ПСС,пик, соответствующий отдельным молекулам полиэлектролита не появляется привысоких концентрациях полиэлектролита, вероятно из-за сильной агрегации в растворепод действием ГХГ. Другая особенность результатов по динамическому рассеяниюсвета для смешанных растворов лизоцим/ПСС/ГХГ состоит в образовании маленькихчастиц диаметром 5-7 нм при концентрациях ПСС свыше 2*10-3 мг/мл.

Можнопредположить, что при высоких концентрациях ПСС, часть молекул лизоцима повторносворачивается. При этом большая часть белка остается в полностью развернутомсостоянии и связана с ПСС.Сильное влияние ПСС на структуру адсорбционного слоя лизоцима характернотолько для растворов, содержащих ГХГ. Если ГХГ заменить на другой сильныйденатурант – мочевину, то добавление полиэлектролита не приводит к сильнымизменениям кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости (рис.46). Более того, эти зависимости становятся монотонными даже при высокойконцентрации мочевины. Это различие между свойствами растворов лизоцим/ПСС/ГХГи лизоцим/ПСС/мочевина, вероятно, связано с различием в механизме разворачиваниябелка под действием ГХГ и мочевины.

В случае растворов, содержащих ГХГ, молекулыденатуранта диссоциируют в водном растворе и заряженные ионы взаимодействуютпреимущественно с гидрофильными участками на поверхности глобулы [68].Взаимодействие ПСС с белком, снижает заряд глобул и уменьшает электростатическоеотталкивание между лизоцимом и ГХГ. Таким образом, полиэлектролит способствуетвзаимодействию между белком и денатурантом и последующему разворачиванию.

Сдругойстороны,мочевинанедиссоциируетврастворе,взаимодействуетпреимущественно с нейтральными гидрофобными областями поверхности глобулы и неможет заметно влиять на третичную структуру комплекса. Различия механизмовразвертывания глобул белков под действием ГХГ и мочевины широко обсуждаются влитературе [68,69,93]. Измерение поверхностных дилатационных реологических10475r , мН/м604530150050100150200t, мин250300Рис. 46. Кинетические зависимости действительной части динамической поверхностнойупругости растворов смесей лизоцим/ПСС/мочевина при рН=7 концентрации ПСС 0,мочевины 5М (треугольники); концентрации ПСС 0, мочевины 8М (круги);концентрации ПСС 2*10-2 мг/мл, мочевины 5М (квадраты); концентрации ПСС 2*10-2мг/мл, мочевины 8М (звездочки).свойств растворов белков в присутствии этих денатурантов и полиэлектролитовпозволяет проверить некоторые предложенные гипотезы.105VI.

Кинетика адсорбции комплексов глобулярный белок/полиэлектролитПолиэлектролиты сильно влияют на кинетические зависимости поверхностныхсвойств растворов глобулярных белков. Если компоненты одноименно заряжены,скорость адсорбции заметно уменьшается с ростом концентрации полиэлектролита из-заувеличения электростатического барьера адсорбции. В этом случае для описанияадсорбции глобулярных комплексов можно использовать кинетическую модель,представленную в параграфе I.5., и оценить заряд адсорбирующейся частицы на основесравнения расчетных и экспериментальных кинетических зависимостей величиныадсорбции.Интегрирование уравнения (20) при θ = 0 в начальный момент времени (t=0)позволяет получить зависимость θ от возраста поверхности в неявном виде1 4 RT tDn  0exp a RTd6 3 2 (1  4   1,4069 3 )2(44)Если известен размер и заряд частицы, то соотношение (44) позволяет рассчитатькинетическую зависимость поверхностной концентрации.

Характер зависимостейдинамической поверхностной упругости от поверхностного давления для растворовсмеси БСА/ПСС при рН=7 позволяет предположить, что на поверхности адсорбируютсяв основном глобулы белка (параграф II.2.). Окружающая их рыхлая оболочкаполиэлектролита легко вытесняется в подповерхностный слой и, по-видимому, лишьнезначительно влияет на диффузию комплексов белок/полиэлектролит к межфазнойгранице. В этом случае можно приближенно принять, что размер адсорбирующейсячастицы сопоставим с размерами глобулы БСА (4 нм).

Тогда при сравненииэкспериментальныхирасчетныхкинетическихзависимостейповерхностнойконцентрации заряд частицы оказывается единственным подгоночным параметром.Прямое сравнение кинетических зависимостей поверхностной концентрации,полученных из представленных ранее результатов эллипсометрических измерений спомощью соотношения (38), невозможно из-за высокой ионной силы исследованныхрастворов (I=0,02 М). В этом случае эффективная толщина двойного электрического106слояоказываетсясравнимойсразмерамибелковыхглобул,инарушаетсясправедливость соотношений, представленных в главе I.5. Поэтому были проведеныэллипсометрические измерения при меньшей ионной силе I=0.002 М.На рис. 47 представлены кинетические зависимости адсорбции, полученные изэллипсометрических данных с помощью соотношения (38) и соответствующие имрасчетныекривые.Приопределенииповерхностнойконцентрацииизэллипосметрических данных использовался инкремент показателя преломления длярастворов БСА, равный 0,19 см3/г.Поверхностная концентрация на начальной стадии адсорбции уменьшается врезультате замедления адсорбции из-за увеличения заряда комплекса за счетвзаимодействиябелкасполиэлектролитом(рис.47).Увеличениезарядаадсорбирующейся частицы приводит к значительному росту электростатическогоадсорбционного барьера.

Характеристики

Список файлов диссертации