Диссертация (1145920), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Mad1формирует гомодимер, который связывает две молекулы белка Mad2 иобразует комплекс Mad1-Mad2 (Sironi et al., 2002). Mad1 имеет ортологов умногих эукариот от дрожжей S. cerevisiae до человека (Sironi et al., 2002).Белок состоит из двух почти равных α-спиральных участков с небольшимнеструктурированным фрагментом почти посередине. Именно в районе этогонеструктурированного участка происходит присоединение Mad2 (Sironi et al.,2002). У дрожжей S. cerevisiae в центральной неструктурированной областибелка Mad1 находится участок, почти на 70% состоящий из остатковаспарагина.
Такой фрагмент, богатый аспарагином, отсутствует у ортологовMad1 даже в рамках группы Ascomycota, в соответствие с выравниваниями,размещеннымивбазеданныхHomoloGene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene). Наличие такого N-богатого участкаявляется отражением специфичного для дрожжей-сахаромицетов процессанакопления в белках последовательностей, богатых аспарагином (An et al.,2016).
Причины такого накопления до сих пор неизвестны. Стоит отметить,что наличие неструктурированных участков, богатых аспарагином иглутамином, является одним из признаков дрожжевых прионных доменов(Harrison and Gerstein, 2003; Toombs et al., 2010).Интересно, что делеция гена MAD1 приводила к усилению токсическогоэффекта от агрегации α-синуклеина в дрожжевых клетках (Willingham et al.,2003). Возможно белок Mad1 вовлечен в механизм защиты клеток оттоксического воздействия амилоидов. Было показано, что рядом с полярным103тельцем веретена располагается немембранный компартмент, в которомнакапливаются белковые агрегаты – агресома (Wang et al., 2009).Формирование агресомы снижает токсичность белковых агрегатов, которые внее попадают.
Mad1, который участвует в контроле сборки веретена деления,возможно связан с формированием и агресомы. В то же время, делеция MAD1не сказалась на росте дрожжевых клеток на фоне сверхпродукцииполиглутаминового домена хантингтина, что ставит под сомнение связь Mad1с формированием агресомы (Willingham et al., 2003).Таким образом, белок Mad1 формировал олигомеры не зависимо отприсутствия агрегатов Sup35Nwt-YFP или Sup35NN-YFP.
Эти олигомерыобладали некоторыми характеристиками, свойственными амилоидам, вчастности были устойчивы к обработке детергентом додецил-сульфатомнатрия (Рисунок 20). При сверхпродукции агрегаты белка Mad1-CFPколокализовались с агрегатами, формируемыми Sup35Nwt-YFP или Sup35NNYFP в [PIN+] штамме, что может свидетельствовать об их коагрегации.Включением Mad1 в более тяжелые агрегаты можно объяснить то, что спомощью PSIA-HPLC-MALDI (Antonets et al., 2016; Nizhnikov et al., 2014) этотбелок был идентифицирован только на фоне сверхпродукции Sup35Nwt-YFPили Sup35NN-YFP в [PIN+] штамме, но не в контроле.
Можно предположить,что при подготовке проб для полуденатурирующего фореза связь Mad1 сагрегатами Sup35Nwt-YFP или Sup35NN-YFP разрушается, в связи с чем нафорезе мы видим только олигомеры. В целом, полученые в данной работерезультаты по белку Mad1 открывают перспективы для дальнейшего изучениявзаимосвязи амилоидогенеза со стабильностью генетического материала.6.4 Прионы [PSI+] и [PIN+] оказывают различное влияние наагрегацию QN-богатого фрагмента белка Gln3Взаимодействие QN-богатых последовательностей с дрожжевымиприонами возможно в двух направлениях. С одной стороны, сверхпродукция104и агрегация QN-богатых белковых последовательностей в дрожжевых клеткахможет способствовать индукции прионов или полимеризации других белков.Это явление рассматривалось в предыдущем подразделе. С другой стороны,наличие прионов может влиять на способность последовательностей, богатыхаспарагином и глутамином агрегировать.
Примером такого взаимодействияможет быть влияние приона [PIN+] на агрегацию N-терминального доменабелка Sup35 (Derkatch et al., 1997). В работе С. Алберти с соавторами былвыявлен ряд белков, QN-богатые домены которых, слитые с желтымфлуоресцентным белком YFP, формировали амилоидоподобные агрегаты присверхпродукции (Alberti et al., 2009). Эксперименты проводили в штамме[PIN+], однако роль этого приона в агрегации QN-богатых доменов не былаустановлена. Наличие приона [PIN+] не всегда является необходимым дляиндукции агрегации QN-богатых доменов. Примером этого может служитьамилоидогенный домен белка New1 (Osherovich and Weissman, 2001).Некоторые из выявленных в работе С.
Алберти с соавторами белковвзаимодействовали с известными прионными белками дрожжей (Alberti et al.,2009). Так, белок Gln3 репрессируется белком Ure2, детерминантом [URE3](Bertram et al., 2000). В нашей работе было изучено влияние двух дрожжевыхприонов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатого участка белка Gln3(Gln3QN). Было показано, что агрегация Gln3QN, слитого с желтымфлуоресцентным белком YFP, зависит от обоих этих прионов.
Gln3QN-YFP снизкой частотой формирует агрегаты в клетках [psi-][pin-], но прионы [PIN+] и[PSI+] усиливают агрегацию этого белка, при этом эффект [PIN+] значительносильнее, чем [PSI+] (Рисунок 21 и Рисунок 22). Известно, что присутствиеагрегатов одних QN-богатых белков может индуцировать агрегацию других.Этим, по-видимому и объясняется усиление агрегации Gln3QN-YFP на фонеприонов [PSI+] и [PIN+]. Свидетельством в пользу того, что агрегаты Sup35 иRnq1 выступают в роли «затравки» для Gln3QN-YFP, является колокализацияагрегатов Gln3QN-YFP с агрегатами, формируемыми Sup35NM-CFP и Rnq1CFP (Рисунок 25, Рисунок 26 и Рисунок 27). Стоит отметить, что Sup35 в105прионном состоянии является более слабым индуктором, чем Rnq1, чтовыражается в более низкой частоте формирования агрегатов Gln3QN-YFP.Интересно, прион [PSI+] выступал в как в качестве индуктора, так исупрессора агрегации QN-богатого участка Gln3.
Если в штамме [pin-] прион[PSI+] способствовал усилению агрегации Gln3QN-YFP, то в штамме [PIN+] онподавлял эффект приона [PIN+] и снижал частоту формирования агрегатовGln3QN-YFP (Рисунок 22). Подобное антагонистическое действие [PSI+] ужебыло показано при взаимодействии с прионом [URE3] (Schwimmer andMasison, 2002), а также в штамме с тремя прионами [PSI+], [PIN+] и [SWI+] (Duand Li, 2014). Механизмы такого влияния [PSI+] на агрегацию других белковна настоящий момент не до конца ясны.
Можно предположить, что ослаблениеагрегации Gln3QN-YFP в штамме [PSI+][PIN+] по сравнению с [psi-][PIN+]связано с тем, что агрегаты Sup35 связывают часть мономеров Gln3QN-YFP,но слабее индуцируют их агрегацию, чем прионные полимеры Rnq1. Такжеагрегаты Sup35 в [PSI+] могут связывать ряд других дрожжевых белков,которые могут оказывать влияние на агрегацию Gln3QN-YFP.В целом, было показано, что агрегация QN-богатого участка белка Gln3сильно зависит от сочетания дрожжевых прионов [PSI+] и [PIN+], и, что прион[PIN+] является более сильным индуктором агрегации Gln3QN, чем прион[PSI+].1067 ЗаключениеРабота посвящена изучению факторов, влияющих на амилоидогенезQN-богатыхбелковыхпоследовательностей,иэффектаэтихпоследовательностей на индукцию амилоидогенеза других белков.
Прионы[PSI+] и [PIN+] усиливают агрегацию фрагмента белка Gln3, богатогоаспарагином и глутамином. [PIN+] является более сильным индукторомагрегации, чем прион [PSI+]. Несмотря на то, что в [pin-] штамме [PSI+]усиливал агрегацию Gln3QN-YFP, в [PIN+] штамме присутствие [PSI+]приводило к снижению частоты формирования агрегатов Gln3QN-YFP.Двойственный эффект [PSI+] интересен, и требует дальнейших исследований.Влияние QN-богатых последовательностей на амилоидогенез былорассмотрено в рамках изучения эффекта разных вариантов N-домена Sup35 наиндукцию приона [PSI+] и индукцию амилоидогенеза других дрожжевыхбелков.
Вариант N-домена Sup35 с заменой всех остатков глутамина нааспарагин, несмотря на более сильные прионные свойства по сравнению снативным вариантом N-домена, значительно хуже индуцировал переходполноразмерного белка Sup35WT в прионное состояние. Вариант N-доменаSup35 с заменой всех остатков глутамина на фенилаланин, не индуцировалприон [PSI+] и агрегировал независимо от наличия фактора [PIN+]. Такимобразом,сходствосвойстваминокислотныхостатковвсоставеамилоидогенных последовательностей взаимодействующих белков являетсяважным фактором для кросс-индукции амилоидогенеза.Агрегация белка Sup35NN-YFP с бóльшим содержанием аспарагина, чемв Sup35Nwt-YFP, способствовала полимеризации бóльшего количества белков,из которых только один Mad1 содержал участок, богатый аспарагином. Этиданные указывают на то, чтоамилоидогенныхтрактахзамена глутамина на аспарагин вприводиткусилениюспособностипоследовательностей индуцировать амилоидогенез других белков.107этих8 Выводы1.
Варианты N-домена белка Sup35 с заменами глутамина на аспарагин ина фенилаланин формируют амилоидоподобные агрегаты в дрожжевыхклетках.2. Сходство свойств аминокислотных остатков в составе амилоидогенныхпоследовательностей взаимодействующих белков способствует кроссиндукции амилоидогенеза.3. Замены глутамина на аспарагин усиливают способность прионногодомена Sup35 индуцировать агрегацию других белков.4. Белок Mad1 формирует амилоидоподобные детергент-устойчивыеолигомеры в дрожжевых клетках.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
