Диссертация (1145920), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Отсутствие различий поагрегации Sup35NF-YFP в [pin-] и [PIN+] может объясняться тем, что такой97вариант N-домена Sup35 не взаимодействует с агрегатами Rnq1 и является[PIN+]-независимым. Стоит отметить, что по результатам SDD-AGEолигомеры варианта N-домена с заменами глутамина на фенилаланинсущественно легче олигомеров, образуемых Sup35Nwt-YFP или Sup35NN-YFP(Рисунок 15). Это хорошо согласуется с данными полученными в работе А.Александрова с соавторами, где изучалось влияние вставок различныхаминокислот в полиглутаминовую последовательность(Alexandrov et al.,2012). Было показано, что вставка ароматических аминокислот (в том числефенилаланина) в последовательность полиглутаминового (поли-Q) трактаспособствует фрагментации агрегатов этого домена шапероном Hsp104.
Этопроявляется в уменьшении молекулярного веса олигомеров поли-Q тракта содобавлением фенилаланина на полуденатурирующем форезе (Alexandrov et al.,2012). Аналогичную ситуацию мы наблюдаем в случае с N-доменом Sup35 сзаменами глутамина на фенилаланин. Вместе с тем, вполне возможно, чтонебольшой размер олигомеров Sup35NF-YFP связан не с их фрагментацией, ас тем, что амилоидогенная последовательность, обогащённая фенилаланиномне может формировать высокомолекулярные фибриллы.Важной особенностью N-терминального домена белка Sup35 являетсяего способность при сверхпродукции в [PIN+] штаммах индуцироватьприонное состояние [PSI+] у полноразмерного Sup35 (Chernoff et al., 1993;Zhou et al., 2001).
Мы показали, что замена глутаминов на аспарагины в Nдомене Sup35 приводила к существенному снижению его способностииндуцировать [PSI+] у полноразмерного нативного Sup35 (Sup35WT) (Рисунок16). Замена остатков глутамина на остатки фенилаланина приводила кполному отсутствию индуктантов [PSI+] (Рисунок 16). Стоит отметить, чтосверхпродукция N-домена Sup35 с заменой всех остатков глутамина нааспарагин в штамме с полноразмерным Sup35 с таким же N-доменом приводитк более высокой частоте индукции [PSI+], чем сверхпродукция нативного Nдомена в штамме с Sup35WT(Halfmann et al., 2011). Таким образом, уменьшениеколичества индуктантов Sup35WT при сверхпродукции Sup35NN-YFP по98сравнению со сверхпродукцией Sup35Nwt-YFP связано с тем, что агрегатыSup35NN-YFP хуже взаимодействуют с Sup35WT, или такое взаимодействиереже приводит к прионной конверсии Sup35WT.Замена остатков глутамина на фенилаланина в N-домене Sup35, повидимому, делает полностью невозможным взаимодействие N-домена сSup35WT.Возможно,агрегированномSup35NN-YFPсостояниииSup35NF-YFPпространственнуюформируютструктуру,всильноотличающуюся от той, которую принимает N-домен Sup35WT в прионномсостоянии.
В то же время, программа ArchCandy (Ahmed et al., 2015)предсказала наличие точно таких же β-арок у Sup35NN-YFP, что и у Sup35NwtYFP. У белка Sup35NF-YFP ArchCandy не предсказала некоторые β-арки,которые были предсказаны для Sup35Nwt-YFP, однако эти арки обладаютнизким счетом и вряд ли вносят серьезный вклад в структуру Sup35Nwt-YFP(Рисунок 13).
Таким образом, представляется более вероятным, что разныйпотенциал к кросс-индукции амилоидогенеза связан скорее не с различиемпространственной структуры, формируемой полипептидной цепью, а сразными радикалами у глутамина и аспарагина и фенилаланина. Большойароматический радикал фенилаланина может препятствовать сближениюполипептидных цепей Sup35NF-YFP и Sup35WT и формированию кросс-βслоев. Радикал аспарагина в большей степени похож на радикал глутамина, именее препятствует такому сближению.
Этим может объясняться то, что, хотьи с низкой частотой, но Sup35NN-YFP индуцирует переход Sup35WT в прионноесостояние. Стоит отметить, что радикал аспарагина меньше радикалаглутамина и не должен препятствовать формированию кросс-β-слоев. В связис этим причины снижения частоты индукции [PSI+] у Sup35WT присверхпродукции Sup35NN-YFP остаются не до конца ясны.На основании полученных результатов можно заключить, что сходствоаминокислотных остатков в составе амилоидогенных последовательностейвзаимодействующих белков является важным фактором для кросс-индукцииамилоидогенеза.
.996.2 Влияние сверхпродукции N-домена Sup35 на индукциюамилоидогенеза других белков в дрожжевом протеомеФормированиеамилоидныхагрегатоводнимибелкамиможетприводить к индукции агрегации других белков. При этом такое воздействиеносит избирательный характер. Так, при сверхпродукции полиглутаминовогодомена хантингтина в дрожжевых клетках агрегировали только шесть белковиз всего протеома (Nizhnikov et al., 2014). Все эти белки, за исключениемодного, тоже содержали QN-богатые тракты.Известно, что сверхпродукция и агрегация N-домена белка Sup35 в[PIN+] штамме индуцирует переход в амилоидное состояние как минимумодного белка – полноразмерного Sup35 (Chernoff et al., 1993; Zhou et al., 2001).В нашей работе был выявлен набор белков, амилоидогенез которыхвызывается агрегацией нативного и модифицированного N-домена белкаSup35 в штамме [PIN+]. Для оценки роли аминокислотного состава, помимонативного N-терминального домена белка Sup35, был использован вариант Nдомена с замена всех остатков глутамина на остатки аспарагина.
Этот вариантN-домена также взаимодействовал с белком Rnq1 и индуцировал переходполноразмерного Sup35 в прионное состояние (Рисунок 16). В то же времяможно было ожидать, что из-за различий в аминокислотном составе междуSup35NN и Sup35Nwt, их агрегация будет индуцировать амилоидогенез разныхгрупп белков.В ходе данной работы с помощью разработанного в нашей лабораторииметода протеомного скрининга амилоидов PSIA-HPLC-MALDI (Antonets et al.,2016; Nizhnikov et al., 2014) было идентифицировано пять белков, которыеприсутствовали во фракции детергент-устойчивых агрегатов на фонеагрегации белка Sup35NN-YFP и не были выявлены в контроле (Таблица 8).Выявление белков во фракции детергент-устойчивых агрегатов являетсясвидетельством в пользу того, что они могут формировать амилоидоподобныеагрегаты (Nizhnikov et al., 2014). Интересно, что все пять белков были100выявлены на фоне сверхпродукции Sup35NN-YFP.
Только один из пяти белковбыл выявлен в штамме, в котором сверхпродуцировали Sup35Nwt-YFP(Таблица 8). На основании этих данных можно предположить, что вариант Nдомена с заменой всех остатков глутамина на аспарагин обладает большойспособностью к индукции амилоидогенеза других белков, чем нативныйвариант Sup35N. Такое утверждение отчасти согласуется с результатами,полученными в работе Р. Хафманна, согласно которым замена всех остатковглутамина на остатки аспарагина в прионном домене Sup35 ускоряла переходэтого белка в амилоидное состояние и увеличивала частоту его прионизации(Halfmann et al., 2011). Таким образом, увеличение доли аспарагина в белкеприводит к усилению его амилоидогенных свойств. Это может объяснятьсятем, что аспарагин имеет меньший радикал, по сравнению с глутамином, чтопозволяет полипептидным цепям сильнее сближаться и формировать β-слои.Среди белков, идентифицированных на фоне сверхпродукции Sup35NNYFP, был Ctt1 (Таблица 8).
Этот белок обладает каталазной активностью иучаствует в защите от оксидативного воздействия на дрожжевые клетки(Traczyk et al., 1985). Недавно было показано, что в штаммах с делецией генаCTT1 повышена частота возникновения de novo приона [PSI+] (Doronina et al.,2015). Возможно, белок Ctt1 снижает частоту индукции [PSI+], связываясь сфибриллами Sup35. Коагрегация Ctt1 c Sup35NN-YFP может быть причинойтого, почему белок был выявлен во фракции детергент-устойчивых агрегатов.Единственным белком, идентифицированным с помощью PSIA-HPLCMALDI (Antonets et al., 2016; Nizhnikov et al., 2014) в [PIN+] штаммах на фонесверхпродукции как Sup35Nwt-YFP, так и Sup35NN-YFP, является белок Mad1(Таблица 8).
Примечательно, что это также единственный из пяти выявленныхбелков,которыйсверхпродукциясодержитQN-богатыйSup35NN-YFPприводитучасток.кТакимполимеризацииобразом,белков,содержащих не только QN-богатые участки. Большинство белков, которыеполимеризовалисьнафонеагрегацииполиглутаминовогодоменахантингтина, содержали QN-богатые участки (Nizhnikov et al., 2014).101Преобладание QN-богатых белков в том эксперименте может быть связано стем, что полиглутаминовый домен содержит протяженный (100 аминокислот)участок,состоящийтолькоизостатковглутамина,формирующийнепрерывную бета-цепь. В случае Sup35NN доля аспарагиновых остатков в(44%), по-видимому, не достаточна для того, чтобы вызывать полимеризациюпреимущественно белков с QN-богатыми участками. Таким образом, белки,содержащие относительно короткие амилоидогенные тракты, состоящие изразных аминокислотных остатков, являются не столь эффективной матрицейдля кросс-индукции амилоидогенеза, как протяжённые полиглутаминныетракты.6.3 Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры независимо от присутствия агрегатов N-терминального домена Sup35С помощью метода PSIA-HPLC-MALDI (Antonets et al., 2016; Nizhnikovetal.,2014)былидентифицировантолькоодинбелок,которыйполимеризовался на фоне агрегации как Sup35Nwt-YFP, так и Sup35NN-YFP, –Mad1.Болеетого,Mad1оказалсяединственнымбелкомиз5идентифицированных, который содержал участок, богатый аспарагином иглутамином.
Было показано, что Mad1, слитый с циановым флуоресцентнымбелком, формировал при сверхпродукции агрегаты как на фоне агрегациибелков Sup35Nwt-YFP или Sup35NN-YFP, так и в клетках, которые непродуцировали эти белки (Рисунок 19). С помощью полуденатурирующегоэлектрофореза было показано, что Mad1-CFP формировал детергентустойчивые олигомеры не зависимо от присутствия белков Sup35Nwt-YFP илиSup35NN-YFP как при сверхпродукции, так и при нативном уровне продукции(Рисунок 20).Агрегаты белка Mad1-CFP колокализовались с агрегатами Sup35NwtYFP и Sup35NN-YFP, при этом частота колокализации с агрегатами Sup35NNYFP была как минимум в два раза выше (Рисунок 19). Стоит отметить, что в102середине последовательности белка Mad1 находится участок, крайнеобогащенный аспарагином.
Возможно, именно этим и объясняется болеевысокая частота колокализации с агрегатами Sup35NN-YFP (доля аспарагина44% в Sup35NN против 15% в Sup35Nwt).Mad1 является суперспиральным белком, участвующем в контрольнойточке сборки веретена деления (Chen et al., 1999; Li and Murray, 1991).Нарушение регуляции сборки веретена деления может приводить кнестабильности поддержания числа хромосом (Barnhart et al., 2011).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
