Автореферат (1145885), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Уровень достоверности р < 0,05 былпринят как статистически значимый.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕПлотные контакты в структуре альвеолы молочной железы мыши.Альвеолы молочной железы образованы однослойным эпителием, размеры клетоккоторого варьируют в пределах альвеолы. Эпителиоциты плотно прилегают своимибазолатеральными поверхностями друг к другу, формируя полость альвеолы.Особенности ультраструктуры секреторного эпителия молочной железы позволяютчетко идентифицировать на электронограммах апикальную и базальную часть клеток.На фотографиях, полученных с помощью электронного микроскопа, видно, что наповерхности клеток, обращенной в полость альвеолы, есть микроворсинки.
Ядро вклетках секреторного эпителия смещено к базальной области. В нем определяютсяобширные зоны эухроматина, что характерно для активно синтезирующих клеток.Электронограммы позволяют проанализировать типы межклеточных контактов вэпителии молочной железы. На боковых поверхностях соседних клеток не обнаруженызоны адгезии и десмосомы. Стоит отметить наличие на латеральной плазмалеммеклеток интердигитаций - соединений по типу «замка», образующихся в результатеинвагинации плазматических мембран соседних клеток (рисунок 1 А).
В апикальнойобласти секреторных клеток на всех электронограммах альвеол хорошо видны плотныеконтакты. Они определяются как электронно-плотные структуры в местах соединения11апикальных участков плазматической мембраны соседних клеток. Характерной чертойстроения плотных контактов является кажущееся слияние плазматических мембрансоседних клеток, приводящее к исчезновению в этом участке видимого межклеточногопространства. В базолатеральной области между соседними клетками оно хорошопросматривается.
В зоне плотного контакта, на мембранах соседних клеток, всегда естьмикроворсинки. На остальной части апикальной мембраны их может не быть или ониредко расположены. В полости альвеол различимы гранулы казеина (рисунок 1 Б).Рисунок 1. Ультраструктура секреторного эпителия молочной железы мышиА – общий вид эпителиальных клеток.Б – ультраструктура эпителиальной клетки в зоне плотного контакта.ПК – плотный контакт, Мв – микроворсинки, ГК – гранулы казеина, СГ – секреторныегранулы, Ид – интердигитации, МП – межклеточное пространство.
ПА – полостьальвеолы.Стрелки указывают на соответствующую структуру.Локализация белка-маркера плотных контактов окклюдина. Окклюдинявляется необходимым молекулярным компонентом плотных контактов, поэтому егоиспользуют в качестве маркера этих структур. Применение антител к окклюдинувыявляет в секреторных клетах сеть плотных контактов. Сопоставление свеченияокклюдина относительно ядра клетки и полости альвеолы указывает на расположениеэтого белка в апикальной части цитоплазматической мембраны секреторных клетокальвеолы. Свечение белка-маркера окклюдина является предпосылкой для определениялокализации клаудинов в апикальной мембране секреторного эпителия альвеолмолочной железы.12Определение белков плотных контактов в ткани молочной железы мышейметодом Вестерн-блотинга.
В ткани молочной железы при исследовании методомВестерн-блотинга были выявлены клаудин-1, -2, -3, -4, -5, -7, -8, -12, -15, -16 и -17, атакже окклюдин. Анализ результатов проведения Вестерн-блота свидетельствует о том,что частота обнаружения отдельных клаудинов в ткани молочной железы различается.По данному параметру клаудины можно разделить на две группы. К первой группеотносятся те белки, которые обнаруживаются во всех пробах ткани, то есть, их следуетсчитать конститутивными молекулярными компонентами плотных контактов вмолочной железе.
К ним относятся клаудин-1, -4, и -16. Стоит подчеркнуть, чтоокклюдин, который рассматривают как белок-маркер плотных контактов, такжеидентифицировали во всех опытах. Другие клаудины, а именно клаудин-2, -3, -5, -7, -8,-12, и -15, определяются не в каждой пробе ткани молочной железы, поэтому их можноотнести к индуцибельным компонентам плотных контактов, то есть появляющимся приопределенных условиях.
В эту группу входят клаудин-2, -3, -5, -7, -8, -12, и -15(рисунок 2).Локализация белков плотных контактов в секреторном эпителии альвеолмолочнойжелезыконфокальноймыши.Использованиесканирующейлазернойметодамикроскопиииммунофлуоресфенциипозволилоиопределитьрасположение белков плотных контактов в эпителии альвеолы молочной железы.Клаудинылокализовалисьвпределахплотныхконтактовсвидетельствует наличие желтого свечения на имиджах (рисунок 3).эпителия,очем13Рисунок 2. Спектр клаудинов в ткани молочной железы мышейРисунок 3.
Локализация белков плотных контактов в эпителии альвеолы молочнойжелезыА – определение клаудина-1, Б – определение клаудина-16 в зоне плотного контактаЖелтое свечение – совместная локализация клаудина и окклюдина.Стрелки указывают на соответствующую структуру.14Изменение структуры альвеол молочной железы мыши при перерыве вкормлении детенышей.
На гистологическом препарате ткани молочной железыопытной группы животных видно, что альвеолы плотно прилегают друг к другу,практически не видна соединительная ткань и кровеносные сосуды. Эпителий альвеолприобретают плоскую форму. Высота секреторного эпителия в контрольной группемышей равнялась 7,1 ± 0,4 мкм (n=50). В опытной группе этот показатель составил 4 ±0,4 мкм (n=50) (p<0,01). Диаметр альвеол в контрольной и опытной группах такжедостоверно различался. Минимальный диаметр в контроле 55 ± 0,1 мкм, в опыте 72 ±0,1 мкм (p<0,01 n=50; t-критерий Стьюдента). Максимальный диаметр в контроле 64 ±0,1 мкм, в опыте 90 ± 0,1 мкм (p<0,01; t-критерий Стьюдента). Таким образом, данныеморфометрических измерений свидетельствуют об увеличении размеров альвеолмолочной железы после отсадки детенышей (рисунок 4).Рисунок 4.
Изменения размеров альвеол молочной железы после завершениякормления и после перерыва в кормлении детенышей (***- p< 0,01)Белые колонки – размеры альвеол после завершения кормления детенышей.Серые колонки – размеры альвеол молочной железы при длительном (20 ч) перерыве вкормлении детенышей .***- p< 0,01Изменение ультраструктуры эпителиальных клеток альвеол молочнойжелезы мыши после длительного перерыва в кормлении.
Накопление секрета вполости альвеол может приводить к изменению конфигурации межклеточногопространстваВконтрольнойгруппемежклеточноепространствомежду15эпителиоцитами представляет собой на электронограммах ровную линию, котораяпрактически не изгибается на всем протяжении латеральной поверхности секреторныхклеток. В противоположность этому, в опытной группе, мембраны, ограничивающиемежклеточное пространство, изогнуты, само межклеточное пространство не имеетстрого ориентированного направления по отношению к полости альвеолы.
Кромеэтого, изменение латеральной поверхности соседних клеток выражается в измененииколичества интердигитаций. В контрольной группе интердигитаций мало, онирасполагаются, в основном, в базальной части. На боковых поверхностях мембраннаблюдается не больше одной пары. В опытной группе количество этих структурвозрастает.Можноутверждать,чтоизменениеконфигурациимежклеточногопространства является одним из признаков накопления секрета в полости альвеолы(рисунок 5).Рисунок 5.
Изменение ультраструктуры эпителиальных клеток альвеол молочнойжелезы мыши после длительного перерыва в кормленииЭпителиальная клетка А− после кормления, Б − после длительной отсадки детенышей.ПА − полость альвеолы, ГК − гранулы казеина, Мв − микроворсинки, ПК − плотныйконтакт, МП − межклеточное пространство, Ид − интердигитации, ЯК − ядро клетки,ЭпС − эндоплазматическая сеть, МаП − межальвеолярное пространство.Стрелки указывают на соответствующую структуру.Изучение активности миелопероксидазы в ткани молочной железы мышей.Активность миелопероксидазы в ткани контрольных животных составляла 52,4 о.д.е.Прекращение выведения молока и накопление секрета в полости альвеол не изменилиактивность данного фермента, составив 61,0 (p≥0,05 n= 6 и 10, соответственно; Uкритерий Манна – Уитни).
Таким образом, установлено, что перерыв в кормлении на16протяжении суток не приводит к развитию воспалительных процессов в эпителиимолочной железы.Изменение уровня белков плотных контактов в молочной железе мышипри перерыве в кормлении детенышей. При накоплении секрета в полости альвеолымолочной железы методом Вестерн-блота был определен тот же спектр клаудинов, чтои в контрольных условиях, а именно: клаудин-1, -2, -3, -4, -5, -7, -8, -15, и -16. Издругих белков плотных контактов был определен белок окклюдин (рисунок 6).Рисунок 6.
Сравнение интенсивности сигналов белков плотных контактов в тканимолочной железы мышей методом денситометрииИнтенсивность сигнала в контроле принимали за 100%.Нижняя панель – примеры блотов клаудинов в ткани молочной железы мыши**р<0,01; ***р<0,001, ocln – окклюдин; cldn – клаудинПо данным денситометрии, при накоплении секрета и увеличении давления вполости альвеолы молочной железы, уровень окклюдина остается без изменения.Среди клаудинов наблюдали разнонаправленное изменение уровня белков. Накоплениесекрета в молочной железе не изменило уровень клаудина-4, -5, -7, -8 и -15. Однако придлительном перерыве в кормлении детенышей самкой увеличилась более чем в трираза экспрессия клаудина-1 и -3 по сравнению с контролем.
В то же время былопоказано снижение в несколько раз клаудина-2 и -16 (n=4-7, р<0,01; U-критерийМанна-Уитни) (рисунок 6).Изучение локализации белков плотных контактов в молочной железемыши при перерыве в кормлении детенышей. Локализация белков плотныхконтактов была определена методом иммуногистохимии с последующим анализом17изображений с помощью сканирующего лазерного микроскопа. Общим для всехклаудинов является то, что они определяются как белки ко-локализованные с белкоммаркеромплотныхконтактоввапикальнойобластиэпителия.Результатыиммуногистохимии свидетельствуют о локализации клаудинов в зоне плотногоконтакта.ДанныепоВестерн-блотухорошокоррелируютсданнымииммуногистохимии, подтверждая изменения в уровне клаудинов при механическомрастяжении альвеолы.Изменение длины плотных контактов эпителиоцитов молочной железы придлительной отсадке детенышей.
Накопление секрета, приводящее к возникновениюмеханического давления на апикальную мембрану эпителия, вызывает изменениедлины плотных контактов. В контрольной группе протяженность этой структуры быларавна 2,1 ± 0,1 мкм. В опытной группе длина плотных контактов увеличилась в два разапо сравнению с контролем и была равна 4,2 ± 0,1 мкм (p<0,01 n= 12; U-критерий Манна- Уитни).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
