Автореферат (1145885), страница 2
Текст из файла (страница 2)
При механическом воздействии на эпителий плотные контактыобеспечивают сохранение его структурной целостности.Личный вклад автора. Данные, изложенные в диссертационной работе,получены лично автором. Автор участвовал в разработке концепции и обсуждениирабочего плана научного исследования, проведении экспериментальной работы,обсуждении результатов и написании выводов. Соавторы указаны в соответствующихстатьях и тезисах.Апробация результатов исследования.Материалы диссертации были доложены и обсуждены на XXII и XXIII CъездахФизиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград 2013,Воронеж 2017) иконференциях: International conference «Barriers and channels formed by tight junctionproteins. From mechanisms to diseases and back» (Berlin, 2011); 91st Annual Meeting of TheGerman Physiological Society (Dresden, 2012); По теме диссертации опубликованы 2статьи в журналах, входящих в список ВАК, и 4 тезисов докладов.Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзоралитературы, глав о методических приемах, экспериментальных исследованиях и ихобсуждений, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на118 страницах печатного текста, содержит 4 таблицы и иллюстрирована 15 рисунками.В списке цитируемой литературы приведено 202 источника.7ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияНа всех этапах экспериментальной работы использовали самок нелинейныхбелых мышей (n=60). Самки, находившиеся на последних сроках беременности (17-20дней), содержались в условиях вивария на стандартном рационе, со свободнымдоступом к пище и воде.
Каждая самка с потомством содержалась в отдельной клетке, встандартных условиях вивария. Эксперименты начинались на десятый день послеродов, в период установившейся лактации. Эксперименты выполнялись в соответствиисо стандартами, принятыми организациями по работе с лабораторными животнымиFELASA и RusLASA.В контрольной группе животных ткань молочных желез фиксировали сразупосле кормления самкой детенышей. В экспериментальной группе детенышейотсаживали от самки, прекращая тем самым выведение секрета из молочной железы, иткань молочной железы брали через двадцать часов после отсадки детенышей.Животных наркотизировали, проводили мастэктомию и фиксировали ткань. Пробыбралидляпроведениягистологического,морфометрическогоииммуногистохимического анализа, электронной микроскопии, определения активностимиелопероксидазы и для определения белков плотных контактов методом Вестернблот.
Мастэктомии подвергались паховые (inguinal mammary gland) молочные железысамок. В зависимости от метода обработки материала, применялась химическаяфиксация или быстрая заморозка в жидком азоте. Для приготовления необходимыхрастворов использовались реактивы фирмы Sigma Aldrich (Германия).Определение белков плотных контактов методом Вестерн-блот. В даннойработе метод Вестерн-блот был использован для определения белков плотныхконтактов в эпителии альвеол молочной железы и для сравнительного исследованияуровня этих белков. Работа проводилась по стандартному протоколу: выделениемембранных белков из ткани, определение концентрации белка с использованиемспектрофотометра (длина волны 562 нм) Tecan Spectra (Tecan, Швейцария).
На основеполученных данных рассчитывали объем каждой пробы для проведения электрофорезав полиакриламидном геле.Дляразделениявыделеннойфракциибелковпомолекулярноймассеиспользовался вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле с концентрациейдодецилсульфатнатрия (SDS) 12,5%. На следующем этапе белки под действием8электрическоготокапереносилисьсполикриламидногогелянаполивинилденфторидные (ПВДФ) мембраны (GE Healthcare, Германия).
Затемпроисходило иммуноокрашивание белков на ПВДФ мембране.ПВДФ мембраны инкубировались в растворе первичных мышиных антител кклаудину-4 и окклюдину (1:1000; 4 ºС) или растворе первичных кроличьих антител кклаудину-1, -2, -3, -5, -7 и -8 (Invitrogen, США) (1:1000; 4 ºС). На следующем этапеПВДФ мембраны промывали в TBST (табл. 1) (3 х 5 мин; 22 ºС) и инкубировали врастворе вторичных козьих анти-мышиных или козьих анти-кроличьих антител,конъюгированных с пероксидазой хрена (Invitrogen, США) (1:1000; 45 мин, 22 ºС).Для визуализации мембраны инкубировали в растворе Lumi-LightPLUS (RocheDiagnostics, Германия) (5 мин, 22 ºС). Детекция сигнала осуществлялась на анализатореизображений LAS-1000 (Fujifilm, Япония).
Обработка изображений выполнялась спомощью программного обеспечения AIDA Raytest 2,5 (Straubenhardt, Германия).Полученные в результате денситометрии значения выражены в оптических единицах.Для последующей статистической обработки данные были переведены в условныеединицы. Контрольные значения принимались за 100%, плотность сигнала в опытевысчитывалась относительно контроля.Изучение гистологической структуры препаратов ткани молочной железы спомощью световой микроскопии. Световая микроскопия дает возможность увидетьналичие или отсутствие изменений, вызванных экспериментальным воздействием вструктуре ткани молочной железы.
Фрагменты ткани молочной железы фиксировали взабуференном 10% формалине (3 часа, 22 ºС) с последующей длительной отмывкой отфиксатора сначала в проточной воде, а затем в фосфатном буфере (PBS) с Ca2+ иMg2+.Процедура заливки ткани в парафиновые блоки и подготовка срезов для окраскипроводилась по стандартной методике. Срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха сдокрашиванием эозином. Оценку гистологической структуры ткани проводили насветовом микроскопе фирмы Leitz (Германия).Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов для изучениялокализации белков плотных контактов.
Иммуногистохимическое окрашиваниепроводили для определения локализации белков плотных контактов вальвеолахмолочной железы. Процедура подготовки срезов для иммуногистохимиическогоисследования идентична процедуре подготовки срезов для световой микроскопии.После депарафинизации стекла со срезами кипятили в 1мМ ЭДТА рН 8.0 (15 мин),затем инкубировали в блокировочном растворе (PBS, 5% молочный порошок, 1% БСА)(120 мин, 22 ºС).
Для определения локализации белков плотных контактов9использовали первичные мышиные антитела к окклюдину и клаудину-4 (1:100; 60 мин,37°С) и первичные кроличьи антитела к клаудину-1, -2, -3, -5, -7, -8 (Invitrogen, США)(1:100; 60 мин, 37 °С).
После промывки стекол блокирующим раствором (3 х 5 мин;22ºС) на срезы наносили вторичные козьи анти-мышиные антитела Alexa Fluor 594 ивторичные козьи анти-кроличьи антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США) (1:500; 45мин, 37°С). Перед нанесением покровных стекол срезы инкубировали с красителемDAPI (Roche, Германия) (1:5000; 5 мин, 22 °С) для визуализации клеточных ядер изатем промывали в дистиллированной воде и в 100% этаноле. Анализ полученныхизображений производился с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 510META (Zeiss, Германия) и программного обеспечения LSM Image Browser (Zeiss,Германия).
Для окраски ядер использовали флуоресцентный краситель DAPI.Исследование ткани молочной железы с помощью электронной микроскопии.Фрагменты ткани молочной железы, взятые для исследования, подвергались обработкепо следующей схеме: префиксация в 2,5%-ом растворе глутаральдегида, на 0,1 Мфосфатном буфере (pH 7,4) с хлоридом кальция (1%), в течение 2 ч при температуре +4оС; постфиксация в 2%-ном растворе четырехокиси осмия (ОsО4) на 0,1 М фосфатномбуфере (pH 7,4) в течение 2 ч при температуре +4 оС; промывка и обезвоживание всерииспиртоввозрастающейконцентрации.Затемследовалопропитываниезаливочной средой и переход к следующим этапам: заливке в отвердевающую смолу«Эпон» и помещению блоков в термостат для полимеризации.
Для выявления зон,оптимальных для электронно-микроскопического исследования, получали полутонкиесрезы на ультрамикротоме Leica EM UC7. Срезы помещали на предметное стекло иокрашивали толуидиновым синим. Препараты изучали в микроскопе JEM-1400,отметив область, пригодную для электронно-микроскопического исследования,переходиликультратонкимсрезам.Ультратонкиесрезыготовилисьнаультрамикротоме Leica EM UC7. Окраска срезов проводилась уранилацетатом ицитратом свинца. Препараты изучали в просвечивающем электронном микроскопеJEM-1400, имеющем максимальное ускоряющее напряжение 120 кВ.Определение активности миелопероксидазы. Миелопероксидаза являетсялизосомальным ферментом, который содержится в азурофильных гранулах вцитоплазме гранулоцитов, и может служить маркером клеток миелоидного ряда.Увеличение активности данного фермента в молоке свидетельствует об усилениимиграции нейтрофилов в процессе развития воспалительной реакции.
Метод основанна окислении О-дианизидина перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы.Для определения общей пероксидазной активности пробы ткани молочной железы10взвешивали с точностью до 0,1 мг, гомогенизировали в 0,1М цитратнофосфатномбуфере (pH=5,7) из расчета 10 мг ткани в 1.5 мл буфера. Полученные тканевыегомогенаты центрифугировали в течение 25 мин. при 500g. Пероксидазную активностьопределяли по скорости окисления о-дианизидина в отобранной надосадочнойжидкости.
Общую пероксидазную активность тканей оценивали в относительных одианизидиновых единицах (о.д.е.), принимая за одну единицу изменение оптическойплотности на 0,001 в течение 1 мин при длине волны 460 нм.Статистическаяпроводиласьсобработка.использованиемGraphPad.Prism.v5.00.ДлярасчетовСтатистическаякомпьютернойиспользовалиобработкастатистическойпрограммурезультатовпрограммыMicrosoftExcel,рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку. При обработке результатовиспользовали парный t-критерий Стьюдента. В опытах, в которых по методическимпричинам приходилось ограничиваться небольшим количеством измерений, применялинепараметрический критерий Манна-Уитни.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
