Диссертация (1145465), страница 46
Текст из файла (страница 46)
находится в открытой областипротонного спектра. Следовательно, обнаружение взаимодействия 7α-Ме/9α является прямымсвидетельством присутствия в растворе конформера (В), так как в конформере (А) при218псевдоэкваториальном положении 7α-метильной группы и протона 9α зарегистрироватьпространственное взаимодействие между ними в виде кросс-пика в спектре NOESYневозможно из-за их удаленности более чем на 5 Å.
Однако, при попытке использоватьинтенсивность кросс-пика 7α-Ме/9α для расчета населенности минорного конформера (В)возникает известная проблема анализа и интерпретации данных по измерению ЯЭО междупротонами, которые входят в состав подвижных групп [178‒180, 183, 186]. Тем не менее,используя соотношение интегральных интенсивностей кросс-пиков 7α-Ме/9α и 7α-Ме/6β,которое равно 1 : 5.2, а также предполагая, что эффективные расстояния r7α-Ме‒9α(В) и r7α-Ме‒6β(А)одинаковы, получаем оценку населенности конформера (В) на уровне 20%. Это явнозавышенная (не менее, чем 2 раза) оценка величины РВ, вероятнее всего, связана спредположением о равенстве сравниваемых расстояний, но она находится в качественномсоответствии с оценкой населенности РВ, полученной на основании наблюдаемых величинскалярных констант.В целях получения дополнительныхподтверждений существования стероида (24) врастворе в виде двухпозиционного конформационного равновесия (А)(В) была сделанапопытка обнаружить с помощью ЯМР 1Н минорный конформер (В) при низких температурах.Но даже при температурах до -60 ºС в CDCl3 не было обнаружено никаких известныхпризнаков динамического обмена.
В диапазоне от +10 до -60 ºС наблюдалось лишь общее длявсего спектра уширение протонных сигналов, связанное с повышением вязкости раствора, а вспектре NOESY после -40 ºС появились явные признаки замедления скорости диффузии из-занизкой температуры в виде уменьшения и исчезновения некоторых кросс-пиков, чтосоответствовало выполнению условия ωоτс ≈ 1.Поэтому дальнейшие низкотемпературные исследования стероида (24) в интервале от 50 до -105 ºС были проведены в менее вязком растворителе ‒ СD2Cl2. При температуре -80 ºСв спектре NOESY был зарегистрирован обменный кросс-пик между дублетным (3J17α-16α(А) =5.1 Гц) сигналом протона 17α(А) при 4.59 м.
д. и крайне слабым триплетным (3J17α-16α(B) ≈ 3J17α16β(B)= 8 Гц) сигналом при 5.14 м. д., который был идентифицирован как сигнал этого жепротона, но находящегося конформере (В) ‒ 17α(В). Этот спектр представлен в приложенииП3 на рисунке П3-2а, а на рисунке П3-2б показана температурная зависимость фрагментаспектра ЯМР 1Н стероида (24) и появление при низких температурах сигналов двух протонов17α(В) при 5.14 м.
д. и 1(В) при 7.20 м. д., соответствующих минорному конформеру (В).Интенсивность этих сигналов крайне мала и сопоставима с интенсивностью сателлиных-13Ссигналов, которые составляют 0.55% от интенсивности сигнала доминирующего конформера(А). Поскольку триплетный сигнал протона 17α(В) при -100 ºС в 1.5 раза превосходит219сателлитный сигнал протона 17α(А), то доля конформера (В) составляет в указанных условияхвсего около 0.8%, а доля конформера (А) – 99.2%. Полученная оценка населенностей РА и РВпри температуре -100 ºС и температурная зависимость скалярных констант позволяют сделатьоценку термодинамических параметров конформационного равновесия стероида (24), а длятемпературы коалесценции Тс, которая для сигнала протона 17α (∆ν = 162 Гц) оказаласьравной 208 ºК, получить значения свободных энергий активации.
Результаты этой работы ввиде зависимости <3J12α-11α> от температуры (Табл. П3-13) и графика зависимости lnK = f(103/T) на рисунке П3-3 приведены в приложении П3, а полученные значениятермодинамических и кинетических параметров даны ниже:∆H = (1.83 ± 0.05) ккал/моль, ∆S = (1.11 ± 0.2) кал.моль.-1град.-1, ∆E(298) = (1.50 ± 0.05)ккал/моль, а при температуре коалесценции ∆E(208) = (1.6 ± 0.05) ккал/моль.∆GA≠(208) = 11.2 ккал/моль и ∆GB≠(208) = 10.1ккал/моль с точностью не хуже ±0.3ккал/моль.Для стероида (24) в качестве доказательства конформационного обмена (А)также использованы температурные зависимости спектров ЯМР на ядрах13(В) былиС, для которыххарактерно типичное для динамического процесса изменение формы линий (уширение,изменение положения усредненных обменом сигналов) в диапазоне температур ниже -30 ºС.Однако, из-за значительно более низкой чувствительности ЯМР13С по сравнению с 1Нобнаружить сигналы минорной формы (В) в СDCl3 не удалось.
Тем не менее, спектры ЯМР13С в при низких температураходнозначно подтверждают конформационный обмен исвидетельствуют о значительном изменении пространственного строения стероида (24) припереходе доминирующей конформации (А) в минорную (В), поскольку практически всесигналы ядер 13С в той или иной степени реагируют на понижение температуры. Это хорошовидно на рисунке П3-4 (см. приложение П3), где показаны различные области спектра ЯМР13С в широком диапазоне температур от 60 до -55ºС.Спектры ЯМР1Н и13С D-гомо-8α,14β аналогов эстрогенов (25а) и (25б) посравнению со стероидом (24) обладают одним очень важным преимуществом, котороезаключается в возможности уже при температурах 0 ‒ -20 º наблюдать процесс разделенияусредненных быстрым обменом сигналов на два набора сигналов, соответствующихконформерам (А) и (В). При температуре -30 ºС все пары таких сигналов находятся в условияхмедленного в шкале времени ЯМР обмена, а их соотношение оказывается соизмеримыммежду собой и составляет примерно 2 : 1.
Это дало возможность на примере изучениястероида (25а) при -40 ºС провести полную идентификацию сигналов в спектрах ЯМР 1Н и 13С220как домирирующего конформера (А), так и минорного конформера (В). Следует отметить, чтосложность процесса отнесения сигналов в этом случае оказывается примерно в два раза выше.Однако, определение всех пар обменивающихся протонов по обменным кросс-пикам вспектре EXSY-NOESY при -20 ºС, а также установление всех пар обменивающихсяуглеродных сигналов по характерным динамическим уширениям линий и слиянию их в одинусредненный сигнал при переходе от медленного обмена к быстрому, заметно упростили этузадачу. Полное отнесение протонных сигналов для двух конформеров позволили оценитьвеличины скалярных констант в каждом из них и сопоставить их между собой.
В результатеэтого были получены доказательства пространственного строения конформеров (А) и (В)стероида (25а) и, следовательно, определен характер конформационных превращений врастворе.Полученное отнесение сигналов в спектре ЯМР 1Н для конформеров (А) и (В) стероидов(25) при -40 ºС, а также значения соответствующих химических сдвигов при температуре 20ºС в условиях их динамического усреднения даны в таблице П3-14 приложения П3, асоответствующие отнесения в спектрах ЯМР13С приведены там же в таблице П3-15. Нарисунке П3-5 в качестве примера процедуры идентификации протонных и углеродныхсигналов в соответствующих спектрах ЯМР в условиях медленного в шкале времени ЯМРобмена (А)(В) показаны фрагменты спектров ЯМР 1Н стероида (25а) при варьированиитемпературы в диапазоне от 60 до -20 ºС, а на рисунке П3-6 представлены фрагментыспектров ЯМР 13С и DEPT-135 при температуре -40 ºС стероида (25б).Роль гомо- и гетероядерных корреляционных спектров (СOSY-DQF, NOESY,HETCORR, HSQC и др.), полученных в условиях медленного обмена (при -40 ºС)ииспользованных для отнесения протонных и углеродных сигналов заключалась в проверкепредварительных результатов анализа динамических эффектов в спектрах ЯМР 1Н и13С,полученных при варьировании температуры, а также в обнаружении через скалярные (1Н‒1Н и1Н‒13С) и пространственные протон-протонные взаимодействия (ЯЭО) пар сигналовобменивающихся протонов в наиболее сложной перекрывающейся области 1.0 ‒ 2.2 м.
д.В качестве примера комбинированного использования корреляционных1методов и13обменных эффектов в спектрах ЯМР Н и С для идентификации перекрывающихся сигналовна рисунке 3-43а показано полное отнесение 24-х мультиплетных сигналов в алифатическойобласти протонного спектра стероида (25а), находящегося в двух формах (А) и (В). Здесьнаходятся сигналы 5-ти СН2-групп (С11Н2, С12Н2, С15Н2, С16Н2, С17Н2) и двух СН-групп (С8Н иС14Н) этих конформеров. Кроме того, в этой же области присутствуют сигналы 3-х метильных221групп (17аβ-ОАс, 7α-Ме, 13β-Ме) в формах (А) и (В), которые еще больше затрудняют анализпротонного спектра.Рис. 3-43. Полное отнесение сигналов в алифатической области спектра ЯМР 1Н стероида(25А) в CDCl3 при температуре -40 ºС.
С помощью вертикальных красных и синих линийпоказана принадлежность протонов к соответствующим атомам углерода в конформациях (А)и (В), соответственно, а горизонтальные цветные стрелки указывают на двухпозиционныйравновесный обмен (А)(В). В верхней части рисунка схематично показано взаимноеположение сигналов четырех протонов кольца С в условиях медленного и быстрого обмена.Таким образом, в этой области спектра находятся сигналы двух различных спиновыхсистем, состоящих из 4-х протонов кольца С (11α, 11β, 12α и 12β) и 8-ми протонов кольца D(8α, 14α, 15α, 15β, 16α, 16β, 17α и 17β). При температуре -40 ºС сигналы всех указанныхпротонов дополнительно разделяются на два набора, соответствующих формам (А) и (В).Соотношение интенсивностей между сигналами одинаковых протонов, но находящихся вразных конформерах, для стероида (25а) в этих условиях составляет 72 : 28 = PA : PB.
Поэтомунаиболее просто для каждого из конформеров были определены положения сигналовпротонов 11α, 11β и 8α, поскольку идентификация сигналов скалярно связанного с ними222протона 9α в двух конформациях в области 2.8 – 3.2 м. д. не вызывает затруднений (9α ‒единственный из метиновых протонов, который пространственно близок к протону 1 и имеетс ним дальнее скалярное взаимодействие с константой около 1.0 Гц).Скалярные и пространственные взаимодействия9α/11α, 9α/11β, 9α/8α для каждого изконформеров показаны на рисунке 3-44, где приведены фрагменты соответствующих спектровCOSY и NOESY при температуре -40 ºС, обеспечивающей условия медленного в шкале ЯМРконформационного обмена (А)(В).
На этом же рисунке для установления сигналов паробменивающихся протонов показан спектр EXSY-NOESY при температуре -20 ºС (Рис. 3-44в),в котором, наряду с кросс-пиками, соответствующими пространственным взаимодействиям,присутствуюткросс-пикиположительнойполярности,соответствующиепереносунамагниченности в результате химического обмена. В случае, если известен сигнал хотя быодного из двух обменивающихся протонов, на основании обменных кросс-пиков и ихмультиплетной структуры может быть определено не только положение в спектре сигналавторого из протонов, но и изменение его мультиплетности по сравнению с мультиплетностьюсигнала первого протона.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
