Диссертация (1144795), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Полуавтоматическойпипеткой-дозатором наносили СК в количестве 20 мкл в форме капли в окно1 ТК4 – исходная фация. Оставшуюся сыворотку помещали в холодильник(+50С) на ночь, из неё на следующий день наносили каплю в окно 7 ТК 4 –суточная фация. Ячейки 2 − 6 использовали для исследования контрольных идублирующих образцов.90Рисунок 2.2 ‒ Тест-карта-4 диагностического набора «Литос-система»(для исследования сыворотки крови)Диаметр капли составлял 5 – 7 мм. Капли высушивали в специальныхмодулях при температуре 220 – 250С, относительной влажности 55%, при неподвижности самой капли и отсутствие потоков окружающего воздуха. Продолжительность дегидратации капли СК до формирования фации составляла18 часов.Сушильный модуль (изготовитель ФГУП «ФНПЦ «Прибор») был выполнен в виде шкафа (Рисунок 2.3) и представлял собой многоярусную каркасную конструкцию, состоящую из двух соединенных между собой секций,на которых навешиваются боковые теплоизоляционные панели, дверцы, датчики влажности и температуры, устройства циркуляции и удаления испаряемой влаги.
Внутри модуля располагали поддоны для высушиваемых образцов, а в нижней части − ИК-нагреватели (ТЭНы). Снаружи шкафов, на боковых стенках были расположены устройства автоматического управления работой шкафов.91Габаритные размеры внутренней камеры сушильного комплекса: высота – 1800 мм, ширина – 1800 мм, глубина: – 400 мм, шаг установки полок –150 мм.Рисунок 2.3 – Сушильные модули ‒ ФГУП ‒ ФНПЦ «Прибор»Благодаря использованию достаточно большей мощности нагревателейи фазовой схемы их подключения (по сигналу от электронного датчика температуры), образец БЖ высушивали с максимальным сохранением органической структуры молекулярных соединений и минимальной остаточной влажностью.Влага, испаряемая в процессе высушивания образцов БЖ, отводиласьиз модуля системой вентиляции и также сорбировалась поглотителем (селикогелем), размещаемым внутри модуля.
Электронная система сушильногомодуля обеспечивала поддержание в автоматическом режиме температуры22 – 25 ºС (± 1 ºС) и влажности 55% (± 5%).Микроскопы. Исследование структурообразующих элементов дегидратированной капли проводили с помощью стереомикроскопа Leica MZ12(Рисунок 2.4 и 2.5).92Рисунок 2.4 ‒ Стереомикроскоп MZ12 фирмы «Leica» с видеонасадкой LeicaDFC300 FX и выводом изображения на экран монитораРисунок 2.5 ‒ Микроскоп БИМАМ Р‒13Стереомикроскоп MZ12 с максимальной апертурой, апохроматическойзум-системой, с револьвером на 2 объектива с плоским полем зрения и эргономическим тубусом. Микроскоп обладал хорошей разрешающей способно-93стью, большой контрастностью изображения.
Увеличение в штатной комплектации 7.1 − 115х, максимальное увеличение 920х. Ввод изображений вкомпьютер осуществляли через стандартный интерфейс USB с помощью видеонасадки Leica DFC300 FX.При исследовании картины течений в высыхающей капле мы использовали также оптический микроскоп БИМАМ Р–13 фирмы ЛОМО с разрешающей способностью 40 – 600х (Рисунок 2.5). В микроскопе БИМАМ Р–13(Рисунок 2.6) использовали ручную настройку с видеонасадкой МФН−11,дающей дополнительное увеличение до 2.5х.Автоматизированный микроскоп Leica MZ16А использовался нами дляоперативной настройки размера изображения и положения плоскости наблюдения по заданной программе.
В опытах глубина резкости не превышала 0.2мм, что позволяло последовательно визуализировать картины течений в высыхающей капле вблизи свободной поверхности, на полувысоте капли. Микроскопию капли в процессе дегидратации проводили в изолированном боксепри температуре 250С, влажности 55% и минимальных воздушных конвективных течениях.2.3. Методы исследования2.3.1.
Метод клиновидной дегидратацииСущность метода клиновидной дегидратации состоит в том, что каплялежащая на плоскости, в сагиттальном разрезе по радиусу представляет собой сферический сегмент – высота которого снижается от центра капли к периферии. В результате такого расположения жидкости в процессе дегидратации концентрация растворенных веществ нарастает быстрее у края капли.При этом происходит перераспределение растворённых компонентов поплощади фации. Хаотическое распределение веществ жидкой фазы БЖ в результате самоорганизации при переходе в твёрдую фазу преобразуется в упорядоченную структуру.94Перевод БЖ в твердую фазу для последующего их морфологическогоисследования проводили с помощью метода клиновидной дегидратации[164]. Постановка метода клиновидной дегидратации осуществляется следующим образом.
В окна тест-карты, расположенной строго горизонтально лабораторной пипеткой последовательно наносили капли БЖ в объеме 20 мкл.Тест-карту помещалали в сушильный комплекс. Продолжительность периодавысыхания (до момента анализа структуры) составляла 18 – 24 часа. По истечении указанного времени препараты исследовали под микроскопом.Использование метода обработки и анализа компьютерных изображений позволило создать четкую картину элементов структуры БЖ по каждойсерии изображений. Проводили качественную оценку структур при формировании фаций БЖ. Запись динамики формирования структур фаций БЖ,выполненная на компьютере, представляла собой последовательность цифровых изображений в виде отдельных кадров либо видеозапись на цифровуюкамеру и компьютер. Полученные изображения и видеофайлы сохраняли впамяти компьютера.
Строгое соблюдение условий в проведении экспериментов позволило получить хорошую воспроизводимость результатов.Исследовали фации СК, хранившуюся в течение суток при температуре50С. То есть, исследовали СК в фазе завершенных биохимических (ферментативных) процессов.Анализ морфологической картины фаций БЖ включал следующиеструктурные параметры: целостность контуров фации, выраженность центральной солевой зоны, радиальную симметрию трещин и секторов, наличиеотдельностей и конкреций, отклонения от нормальной системной организации фации и присутствие в ней локальных патологических образований. Последовательно проводился качественный анализ – описание общей морфологической картины фации и выявленых «маркеров патологии», а затем количественный анализ – обработка изображений фаций с помощью специальнойкомпьютерной программы с расчетом статистических показателей.952.3.2.
Компьютерная обработка изображений фацийбиологических жидкостей полости рта и носовой полостиДля обработки полученных изображений была использована специальная компьютерная программа, разработанная автором. Для анализа изображения использовали некоторые особенности фации. Форма фации обычноприближалась к кругу, и в ее структуре достаточно четко можно было выделить три зоны: краевую, промежуточную и центральную. Учитывая это проводилась аппроксимация указанных областей с помощью трех окружностей,которые располагали соответственно: по внешней кромке, на границе междупериферической и промежуточной зонами, и на границе между промежуточной и центральной зонами.
Каждая из окружностей описывалась координатами центра xi, yi и величиной радиуса Ri где i = 1,2,3 соответственно. На ихоснове рассчитывались следующие величины:Относительная площадь периферической зоны SR1 = ( R1 R2 ) R1 ;222Относительная площадь промежуточной зоны SR2 = ( R2 R3 ) R1 ;22222Относительная площадь центральной зоны SR3 = R3 R1 ;Смещение центра промежуточной зоны относительно центра периферической зоны Sh2-1 = R2 – R1;Смещение центра центральной зоны относительно центра периферической зоны Sh3-1 = R3 – R1;Для анализа структурных особенностей фации компьютерной программой использовался типичный фрагмент, представляющий собой квадратнуюобласть.
При проведении всех исследований она имела фиксированный размер. Для ее расположения визуально выбирался структурированный участокфации, представляющий интерес.Количественные характеристики полученных изображений рассчитывались программой в рамках типичного фрагмента. Типичный фрагмент рас-96сматривался в черно-белом представлении, для этой программы проводиласьавтоматическая балансировка, и устанавливалось одинаковое пороговое значение яркости It. Структурные объекты, имеющие значение поля яркостивыше или ниже порогового, представлялись соответственно в черном илибелом цвете. С учетом этого, в пределах квадратной области рассчитывалоськоличество объектов белого цвета (N), средний размер объектов белого цвета(AS) и процент площади этих объектов (S).В данной работе использовались также такие характеристики, как коэффициент неоднородности поля яркости и фрактальная размерность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
