Диссертация (1144259), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Возможно, это сопровождается изменением олигомерного состоянияS1R и может представлять интерес для дальнейших исследований.Важным свойством липидных мембран, построенных из более сложныхсмесей (например, липидов, содержащих насыщенные и ненасыщенные ацильныехвосты и холестерин) является образование двух несмешивающихся жидкихлипидных фаз: упорядоченной и разупорядоченной. Под упорядоченной фазой влитературе, как правило, подразумевают липидные рафты. Рафты могутфункционировать как сигнальные «платформы», за счет физико-химическихсвойств бислоя привлекать одни белки и исключать другие. В контекстебиологической функции рецептора сигма-1, наличие рафтовых микродоменовнеобходимо для правильной коммуникации между ЭР и митохондриями. Можнопредположить, что подобное белок-липидные взаимодействия стабилизируютобразованные липидные микродомены.- 111 -Таким образом, полученные нами экспериментальные данные на ГОЛпозволяют выдвинуть обоснованную гипотезу о том, что S1R являетсяорганизатором и стабилизатором рафтовых микродоменов в клетке.4.3.2 Внутриклеточная локализация рецептора сигма-1 обусловленаналичием холестерин-узнающих последовательностейВрезультатеанализааминокислотныхпоследовательностейбылопредположено наличие стерол-связывающего участка в составе трансмембраннойспирали рецептора.
Интересно, что последовательность RR ранее была описана влитературе как сигнал удержания S1R в ЭР через COPI-опосредованныймеханизм возврата из аппарата Гольджи в ЭР [155, 259]. В данной работе быловпервые показано, что CARC-последовательности в составе трансмембранногоучастка рецептора отвечают за правильную внутриклеточную локализацию S1R.Путем Было продемонстрировано, что замена любых остатков, необходимых дляузнавания холестерина, или внесение инсерций, разобщающих CARC-мотив,приводит к диффузному перерапределению рецептора в ЭР. На примере мутантнаR7ER8E было биохимически показано, что мутация по участку CARC приводит кперераспределению рецептора из МАМ в ЭР.
Таким образом, впервые былопоказано, что S1R локализуется в определенных областях ЭР благодаря не белокопосредованномумеханизму,аблагодаряпрямымбелок-липиднымвзаимодействиям.Впредыдущихисследованияхрецепторабылиописаныдвапредполагаемых сайта связывания холестерина [223]. Однако, согласно недавноопределенной кристаллической структуре S1R, обе последовательности находятсявдали от мембрано-связанных участков белка [154]. Кроме того, ни для одной изописанных последовательностей не было показано, что она определяетвнутриклеточную локализацию рецептора.
Таким образом, описанные ранеепоследовательности могут представлять собой вторичные, или дополнительныехолестерин-связывающие последовательности, в то время как мотив, описанный внастоящейработе,представляетсяглавнойстуктурнойдетерминантной,определяющей правильное внутриклеточное позиционирование белка.- 112 -4.3.3 Сигма-1 рецептор как основной рафтовый организаторэндоплазматического ретикулумаПредыдущие исследования сигма-1 рецептора действительно согласуются смеханизмом действия S1R, описанным в настоящей работе. В ряде статей былопоказано, что S1R может оказывать влияние на внутриклеточную локализациюрафт-ассоциированных белков-маркеров и стабильность меж-органелльныхконтактов.
Например, нокдаун гена S1R в первичной культуре нейронов приводилк потере ЭР-митохондриальных контактов [260]. В клеточной линии нокдаунрецептора приводил к перераспределению белков, локализующихся в рафтах(таких как флотиллин, Erlin 2 (ER-lipid raft associated protein 2) и кавеолин) в нерафтовые мембраны, а также сопровождался нарушениями везикулярноготранспортамеждуклеточнымикомпартментами[261].Такимобразом,существующие данные показывают, что отсутствие S1R приводит к глобальнымперестройкам в мембранном составе на клеточном уровне; а наличие рафторганизующих свойств рецептора, описанных в данной работе, позволяет, такимобразом, объяснить многозадачность S1R и многообразие наблюдаемыхклеточных эффектов.В данной работе предложена механистическая модель, объясняющаямеханизм функционирования S1R.
Последовательность событий в присутствиирецептора сигма-1 в мембране, содержащей рафтовые, нерафтовые липиды ихолестерин, может быть графически проиллюстрирована на рис. 8. В случае, еслихолестерола в мембране недостаточно для возникновения фазового разделения,фосфолипиды, сфингомиелины и холестерин распределены в бислое примерногомогенно (рис. 26 А). Холестерин предпочтительно взаимодействует сосфингомиелинами. В присутствии рецептора сигма-1 наблюдается кластеризациярецептора и холестерина, что приводит к увеличению локальной (эффективной)концентрации холестерина (переход из точки Ld в точку Lo на фазовойдиаграмме) (рис.
26 Б). Это способствует разделению фаз на Lo (рафтовую) и Ld(нерафтовую) (рис. 26 В). Рецептор сигма-1 стабилизирует образованныелипидные микродомены.- 113 -Рис. 26. Гипотеза о рецепторе сигма-1 как о организаторе микродоменов и стабилизаторелипидных рафтов (пояснения в тексте).Еслиответнавопросонеобходимостирецепторасигма-1дляперераспределения липидов ЭР получен в данной работе, то вопрос одостаточности рецептора сигма-1 как мембранного организатора остаетсяоткрытым. Мыши, нокаутные по гену SIGMAR1, обладают, тем не менее,достаточно слабо выраженным фенотипом депрессии и устойчивостью к сигмалигандам [262, 263]. Холестерин-связывающие участки рецептора консервативны,но только среди млекопитающих. Эти факты указывают на то, что в клетке,вероятно, существуют компенсаторные механизмы, способные компенсироватьутрату белка в клетке.
Одним из таких механизмов может быть компенсацияуровнейбелковойэкспрессиимембранныхканаловирецепторовдлякомпенсации измененной проводимости последних. Вторым механизмом можетбыть наличие другого белка, сходного по своим функциям с рецептором сигма-1.Как было указано ранее, к классу сигма-рецепторов относят, на настоящиймомент, рецепторы 1- и 2-го подтипов. Ген S2R был клонирован лишь в 2016году, и проведенный анализ первичной а.к. последовательности показал, что- 114 -рецептор S2R представляет собой, предположительно, белок с четырьмятрансмембранными участками [264]. Функция его на настоящий момент неочевидна, а также неизвестна атомная структура, но анализ первичной а.к.последовательности указывает также на наличие тандемных холестеринузнающих мотивов.4.3.4 Модель белок-липидного модулирования ионных каналов черезрецептор сигма-1. Связь с нейродегенеративными заболеваниямиНанастоящиймоментизвестно,чторецепторсигма-1способенмодулировать активность ряда ионных каналов плазматической мембраны и ЭР[265].
Ранее было продемонстрировано, что нокаут гена S1R приводит к потереконтактов между ЭР и митохондриями, и соответствующими нарушениями вкальциевой передаче между двумя клеточными компартментами [260]. На данныймомент, «мультизадачность» функций S1R не может быть объяснена лишьналичием белок-белковых взаимодействий между S1R и белками-партнерами.Например, нередко стимуляция агонистами или сверхэкспрессия приводила кодновременному увеличению токов через одни каналы и угнетению токов черездругие [265]. Большинство белков-партнеров были ко-иммунопреципитированы срецептором S1R только в условиях сверхэкспрессии обоих.
Таким образом,актуальным является поиск единого механизма функционирования S1R в клетке,который бы позволил объяснить большинство имеющихся на настоящий моментэкспериментальных данных.В данной работе впервые предложена гипотеза и рабочая модель о S1Rопосредованном модулировании свойств липидного бислоя, а также полученыпервые экспериментальные подтверждения в ее пользу. Во-первых, былопоказано, что внутриклеточное таргетирование рецептора в МАМ-областисвязано с наличием мотива связывания с холестерином.
Во-вторых, показано, чтобелок-липидныевзаимодействияопределяюткластеризациюрецепторавхолестерин-содержащих мембранах и секвестирование холестерина в эти области.В-третьих, эти данные были подкреплены биохимическими исследованиями белкадикого типа и его мутантных при фракционировании органелл. Кроме того, было- 115 -продемонстрировано, что мутантная форма белка не может компенсироватьутраченную функцию рецептора дикого типа по поддержанию синаптическихконтактов в модельных нейрональных культурах. Эти доводы свидетельствуют впользу того, что S1R является важным рафтовым организатором ЭР.Полученные данные имеют чрезвычайно важное биологическое значение.Известно, что мембранные белки и рецепторы проявляют различные активности вмембранах разного липидного состава.
Некоторые ионные каналы более активныв жидкой липидной фазе при низкой концентрации холестерина [266-268]. Другиеионные каналы более активны в рафтовых доменах с высокой концентрациейхолестерина [269, 270]. Рецептор сигма-1 функционирует, по-видимому, путемперераспределения холестерина (и, возможно, других типов липидов) междусвободной от холестерина жидкой липидной фазой и рафтовой фазой ЭР, и,косвенно,такжеплазматическоймембраной,дифференциальноиразнонаправлено регулируя многие мембранные каналы и рецепторы. Следующийпример иллюстрирует наблюдаемые эффекты рецептора сигма-1 на различныхпредставителях группы калиевых каналов плазматической мембраны.
Все каналынаходятсяврафтахплазматическоймембраныи,какпредполагается,взаимодействуют через трасмембранные домены с рецептором сигма-1 идифференциально модулируются в условиях сверхэкспресии. В качестве примерамодуляции не-рафтовых белков приведен пример кальциевых каналов ПМ (табл.5).Табл. 5. Предполагаемый механизм дифференциального модулированияионных каналов через рецептор сигма-1.КаналМодулирование МодулированиеЛокализациячерез S1RхолестериномKv1.3Инактивация при Инактивацияпри Рафты ПМсверхэкспресииувеличении[163]холестерина [271]Kv1.5Активация при Инактивацияпри Рафты ПМсверхэкспресииуменьшении[151]холестерина [272]Kir2.1Инактивация при Инактивацияпри Рафты ПМсверхэкспресииувеличении- 116 -[273]Кальциевый ИнгибированиеканалL- притипасверхэкспресии[275]холестерина [274]Инактивацияпри Не-рафтовая фазауменьшенииПМхолестерина [276]- 117 -ВЫВОДЫ1.СогласноэкспериментальнорентгеноструктурногоанализаустановленнойструктуресС-концевойпомощьюобластиметодаатаксина-3,полиглутаминовый тракт находится в двух конформациях: свободной петли(кристалл С1) и альфа-спирали (кристалл С2).2.
Структурной особенностью полиглутаминового тракта в альфа-спирально йконформации является то, что она стабилизирована двумя сетями водородныхсвязей: между атомами пептидной группы i и i+4 остатков и между карбокси- иаминогруппами боковых цепей остатков глутамина; при этом водородные связимежду боковыми цепями ориентированы параллельно оси альфа-спирали.3. Вновь разработанное пептоидное соединение HNP1 связывается с N-концевойобластью хантингтина с микромолярной аффинностью (Kd=20 мкМ).4. В микромолярных концентрациях HNP1 ингибирует агрегацию мутантногохантингтина в клетках линии HEK293T (снижение в 2,2 раза, p<0.0001). HNP1являетсянейропротекторомвкортико-стриатальноймоделиболезниХантингтона, восстанавливая плотность дендритных шипиков нейронов.5.РеконструированныйS1Rравномернораспределеннаповерхности«гигантских» одномембранных липосом, полученных из липида ДОФХ, икластеризуется в двухкомпонентной липидной смеси, содержащей холестерин.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
