Диссертация (1144259), страница 19
Текст из файла (страница 19)
24) [55]. Настоящее исследованиедемонстрирует, что, вероятно, альфа-спиральная и свободная конформацияявляются наиболее выгодными вторичными структурами полиГ с энергетическойточки зрения. Однако, потенциальный барьер, разделяющий две описанныеструктуры, невысок и, таким образом, структура полиГ зависит как от белковогоконтекста,такиокружающихусловий.Подобноесложноеповедениегомополимерной аминокислотной последовательности может объяснить, почемудля разных белков длина полиГ тракта, при которой развивается заболевание,варьирует в широких пределах от 32Q для атаксина-2 до 54 для атаксина-3 [5].Кроме того, дальнейшие структурные исследования должны учитывать важностьвзаимного влияния фланкирующих последовательностей, а также то, что условияпроведения эксперимента могут оказывать непосредственное влияние нанаблюдаемые вторичные структуры полиГ.- 106 -Ряд исследований посвящены выяснению возможной функциональной ролиполиГ трактов.
Согласно одному предположению, полиГ последовательностиявляются подвижными линкерами, соединяющими белковые домены. Болеесовременные биоинформатические анализы последовательностей показали, чтополиГ может участвовать в стабилизации белок-белковых взаимодействий.Согласно проведенному анализу последовательностей, полиГ часто следуетнепосредственноформированиевзаимодействия.заальфа-спиральнымиспираль-спиральныхПервымучастками,структуриэкспериментальнымвовлеченнымистабилизируетвподобныеподтверждениемданногопредположения может быть структура первого экзона хантингтина, где былопоказано, что участок N17, предшествующий полиГ, формирует спиральспиральные структуры в ассиметрической единице кристалла и структурируетследующий за ним полиГ тракт. В работе Pelassa и коллег была предложенарабочая гипотеза, согласно которой полиГ в конформации случайного клубкаструктурируется во время связывания со своими белками-партнерами [29].
Вструктуре С-концевого фрагмента атаксина-3 было продемонстрировано, что вусловиях экранирования растворителя полиГ формирует стабильную альфаспираль. Таким образом, наши структурные исследования атаксина-3 могутявляться частичным подтверждением данной гипотезы, но, тем не менее,требуются дополнительные исследования, которые позволили бы подтвердитькорреляцию между структурными особенностями полиглутаминового тракта инаблюдаемыми биологическими эффектами.В структуре MBP-Atxn3 остатки глутамина формируют множественныекоординированные водородные связи вдоль полиглутаминовой спирали иограниченное число взаимодействий с MBP. Первым, кто предложил модель,известную, как полярная застежка, был М.
Перутц [246]. Согласно моделиполярной застежки, Q-Q взаимодействия стабилизируют бета-складчатуюконформацию полиглутаминовых агрегатов. Структура Atxn3-C и модельполярнойзастежкидемонстрируют,какQ-Qвзаимодействиямогутстабилизировать вторичную структуру белка. Тем не менее, эффект стабилизации,- 107 -по-видимому, будет гораздо менее выраженным в присутствие сольватирующихмолекул воды. Однако, в тех случаях, когда эффект растворителя будет менеевыражен, как, например, при увеличении локальной концентрации белкавследствие экспансии триплета или аккумуляции полиглутаминовых фрагментов,эффект Q-Q стабилизации может приводить к формированию полиглутаминовыхагрегатов. Исключение растворителя может приводить к ассоциации глутамина,посредством как внутри- так и межмолекулярных взаимодействий, осложняяпротеасомную деградацию агрегатов подобных олигомеров и ускоряя макроагрегацию полиглутамин-содержащих белков.4.2 Нейропротекторные и анти-агрегационные свойства хантингтинсвязывающего пептоида HNP14.2.1 Структурные особенности пептоида HNP1 и предполагаемыймеханизм нейропротекторного действияВ настоящем исследовании путем синтеза пептоидной библиотеки былоидентифицировано соединение HNP1, специфически связывающиеся с Nконцевой областью хантингтина.
Применение пептоидов в качестве блокаторовбелок-белковыхвзаимодействийявляетсяограниченнымвсференейродегенеративных заболеваний. Ранее в нашей лаборатории нами былосинтезировано пептоидное соединение HQP09, связывающиеся с удлиненнымполиГ тратом, и пептоид IAM1, ингибирующий агрегацию амилоид-бета пептида[122, 123]. Несмотря на то, что на настоящий момент атомная структуракомплекса HNP1 с N-концевой областью не была установлена, можнопредположить,способностьючтоанти-агрегационныепептоидаблокироватьсвойствапервыйHNP1обусловленыN17-опосредованныйэтапагрегации.
К настоящему моменту для блокирования образования агрегатовмутантного хантингтина предложены: интратела (VL12.3 и C4) против N17 [103;104], а также недавно идентифицированный пептид P42, предположительновзаимодействующий с первым экзоном Htt [105]. Сверхэкспрессия шаперонина- 108 -TriC, также связывающегося с участком N17, также приводила к уменьшениюагрегации мутантного хантингтина [].Структуры VL12.3/N17 и C4/N17 были определены с помощью РСА [247,248]. В обоих случаях паратопы этих высокоаффинных интрател былипредставленыгидрофобнойгидрофобнымичастьюповерхностями,амфипатическойспираликоторыеN17.связывалисьАвторыссвязываютнаблюдаемые анти-агрегационные эффекты с экранированием гидрофобной частиN17 от межмолекулярных взаимодействий [247, 248]. В то же время, в случаепептоида HNP1 радикалы представлены, преимущественно, гидрофильнымизаместителями.
Можно предположить, что, в отличие от описанных интрател,пептоид HNP1 связываясь с N17, изменяет конформацию амфипатическойспирали, однако, непосредственно не экранирует гидрофобную поверхностьпоследней.4.2.2 Пептоиды как перспективные блокаторы агрегации хантингтинаПротивполиглутаминовоготрактамутантногоХантингтинабылиразработаны специфичные антитела и интратела [26-28]. Кроме того, изпептидной библиотеки был идентифицирован пептид QBP1, связывающийполиглутаминовый тракт [29]. В наших предыдущих исследованиях мыидентифицировалиисинтезировалипептоид,связывающийудлиненныйполиглутаминовый тракт (HQP09) [30]. Антитела против полиглутаминовыхтрактов, пептид QBP1 и пептоид HNP09 показали некоторую эффективность вклеточных и мышиных моделях болезни Хантингтона [27, 28, 30-34].
Однако,созданиевысокоспецифичныхлигандовименнокгомополимернойполиглутаминовой последовательности хантингтина трудно осуществимо напрактике. Причиной этому является, прежде всего, то, что некоторые белки,важные для жизнедеятельности клетки (например, TATA-бокс связывающиебелки) также содержат длинные полиглутаминовые последовательности в общейпоследовательности белка, что, безусловно, снижает терапевтическую ценностьпредложенных лигандов. Идея разработки лигандов для последовательности- 109 -хантингтина, предшествующей полиглутаминовому тракту (амино-концевомуучастку хантингтина N17), должна обойти эти трудности и дать возможностьразработать высокоэффективную терапию для болезни Хантигтона.Анти- и интратела, выработанные против домена N17, показали своюэффективность в качестве анти-агрегационных соединений. Однако, ввиду своейбольшой молекулярной массы (осложняющей целевую доставку антител черезгемато-энцефалический барьер) и низкую стабильность применение антителтрудноосуществимовклиническойпрактике.Втожевремя,сфармакологической точки зрения, пептоиды обладают рядом преимуществ посравнению с традиционными пептидными и белковыми соединениями.
(1)обладают более высоким разнообразием по сравнению с пептидами, (2)вследствие модифицированной пептидной связи, не способны расщеплятьсяпротеазами, что выражается в более высокой стабильности пептоидов in vivo, (3)короткиепептоиды(счисломзвеньевменьше8)являютсямембранопроницаемыми [249-253].Таким образом, полученные в настоящей работе соединения-прототипымогут служить основой для дальнейшей разработки пептоидных препаратов всфере нейродегенерации, в целом, и терапии болезни Хантингтона, в частности.4.3 Белок-липидные взаимодействия рецептора сигма-1 человека4.3.1 Рецептор сигма-1 перераспределяет липиды в модельных бислойныхмембранахОсновной задачей данной части работы было определение молекулярныхмеханизмов, которые позволили бы определить функции S1R в клетке. Для этогобыл выбран биофизический метод, основанный на реконструкции и исследованиирекомбинантного рецептора в модельных бислойных мембранах.Для этого, на первом этапе были получены протеолипосомы, содержащиефлуоресцентно-меченый рецептор, которые использовались для получениягиганскихлипосом.Полученныевезикулыисследовалисьспомощьюконфокальной микроскопии.
Было исследовано распределение рецептора на- 110 -поверхности липосом, полученных из чистого липида ДОФХ, а также смесиДОФХ+20% холестерин, Подобный подход, основанный на функциональнойреконструкции интегральных мембранных белков в липосомы (синтетические илиполученные из липидов плазматической мембраны) ранее применялся для GPIмодифицированных белков, калиевого канала KvAP, бета-секретазы BACE,прионного белка PrP и других [254-258].В настоящей работе было показано, в ДОФХ-везикулах рецептор былравномерно распределен по поверхности липосом, что демонстрирует успешнуюреконструкцию в бислой и отсутствие агрегации в липидных мембранах послеудаления детергента. Однако, в смесях, содержащих холестерин (ДОФХ+20%холестерин), наблюдалось образование кластеров рецептора на мембране ГОЛ.Такие особенности распределения, по всей видимости, были обусловлены белоклипидными взаимодействиями рецептора. С помощью измерений FRAP на«гигантских» липосомах было показано, что эффективная концентрацияхолестерина в бислое уменьшается и увеличивается в районе S1R-кластеров.Таким образом, S1R перераспределяет холестерин в модельных липидныхбислоях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
