Диссертация (1144259), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Для последующей визуализации мембран во все в липидныесмеси вводился флуоресцентно-меченый липид NBD-ФХ 16:0 в концентрации0,1% в/в.Для встраивания была применена следующая процедура: выделенный иочищенныйфлуоресцентно-меченыйсигма-1рецепторсмешивалсяслипосомами, полученными путем экструзии липидной смеси через 100 нм фильтр.Затем, липосомы солюбилизировали смесью детергентов 1% Triton X-100 или 1%DDM. Отношение белка к липидам было в пределах 1:20-1:50 в/в. После этогодетергент удалялся путем адсорбции на гидрофобной смоле BioBeads (2:1 в/всмола:детегент, трижды).
Полученные липидно-белковые мембраны очищалисьот не-реконструированного белка путем центрифугирования в 5%-60% градиентесахарозы.Полученныетакимобразомпротеолипосомысобиралицентрифугированием и ресуспендировали в бессолевом буфере. Встраиваниебелка было подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа.
Для получения«гигантских» одномембранных липосом с диаметром d >10 мкм, пригодных дляконфокальной микроскопии, протеолипосомы наносились на предметное стекло,покрытое тонким слоем 1% агарозы и высушивались при комнатной температуредляформированияпрозрачнойлипиднойпленки.Дляпредотвращениянеобратимой денатурации белка при дегидрировании добавлялася сахароза вконцентрации 1%. Полученную пленку регидрировали в солевом буфере,содержащем 25 мM HEPES pH=8,0, 150 мМ NaCl, 200 мМ сахароза, в течениечаса при 42° C.
Визуализацию «гигантских» липосом осуществляли с помощьюконфокальной микроскопии.Как видно из полученных результатов (рис. 17, верхняя панель), рецепторсигма-1 равномерно распределен на поверхности липосом, полученных из липидаДОФХ. Для получения липосом другого липидного состава использовались смесиДОФХ с холестерином. В данном случае наблюдалась кластеризация рецептора вопределенных областях на поверхности липидного бислоя и соответствующееуменьшение плотности интенсивности диффузно-распределенного рецептора.- 88 -Количественный анализ распределения рецептора по поверхности липосомыпоказал, что вне кластеров плотность рецептора ниже по сравнению слипосомами, полученными из чистого липида ДОФХ и наоборот, очень высоко врайоне кластеров (рис.
17 Б). Количество кластеров составляло, обычно, отодного до трех на липосому.Рис. 17. Реконструкция рецептора сигма-1 в «гигантские» одномембранные липосомыразличного липидного состава. А. Верхняя панель: реконструкция рецептора в липосомы,полученные из липида ДОФХ. Результаты лазерной сканирующей конфокальной микроскопии(S1R-Alexa555, NBD-ФХ).
Нижняя панель: реконструкция рецептора в липосомы, содержащие20% холестерин (S1R-Alexa555, NBD-ФХ). Б. Значения интенсивности канала S1R-Alexa555 влипосоме, полученной из липида ДОФХ (сплошная линия) и липосомы, содержащей 20%холестерин (пунктирная линия).Таким образом, мы заключили, что встраивание рецептора в холестеринсодержащие липосомы приводит к кластеризации рецептора сигма-1. Опираясь наполученныеранеебиохимическиеданныепосвязываниюрецепторасхолестерином, было предположено, что кластеризация рецептора приводит такжек соответствующему перераспределению холестерина в составе модельных«гигантских»липосомиформированиюхолестерин-богатыхлипидныхмикродоменов.3.3.4 FRAP-измерения коэффициентов диффузии мембранных липидовДля определения коэффициентов диффузии использовался метод FRAP(fluorescent recovery after photobleaching, метод восстановления флуоресценциипосле фотовыжигания).
В данном эксперименте небольшая область липидноймембраны «гигантских» липосом, содержащих флуоресцентрую метку NBD-ФХ,- 89 -выжигалась коротким высокоинтенсивным лазерным импульсом (рис. 18 А),после чего измерялось восстановление флуоресценции в данной области вовремени. Нами были измерены коэффициенты диффузии мембранного липидаNBD-ФХ в следующих липидных смесях: 100% ДОФХ, 80% ДОФХ+20%холестерин в присутствии и отсутствии рецептора сигма-1 человека. Примеркривой FRAP-измерения приведен на рис.
18 Б.Наиболее мобильной метка была в липосомах, полученных из чистоголипида DOPC (D=2,11±0,35 мкм2/с) (рис. 18 В). При увеличении концентрациихолестеринанаблюдалосьуменьшениекоэффициентадиффузии,чтосоответствует увеличению вязкости мембраны в присутствии холестерина(D=1,35±0,08 мкм2/с, p=0,02 по сравнению с контролем) [218]. Встраиваниерецептора сигма-1 также приводило к понижению коэффициента диффузиимембранных липидов, поскольку белок представляет собой препятствие длясвободной диффузии метки (D=1,22±0,08 мкм2/с, p=0,01 по сравнению сконтролем). Интересно, что в соответствии с нашим предположением о сигма-1опосредованном перераспределении мембранных липидов, встраивание рецепторав холестерин-содержащие липосомы приводило к обратному эффекту, то естьнаблюдалось увеличение коэффициента диффузии метки (D=1,80±0,29 мкм2/с,p=0,05 по сравнению с контролем ДОФХ+S1R, p=0,50 по сравнению с контролемДОФХ).Вданномэкспериментеизучалисьобласти,свободныеоткластеризованного рецептора.Таким образом, был сделан вывод, что рецептор сигма-1 в модельнойсистеме «гигантских» липосом кластеризуется в определенных областяхлипидной мембраны, секвестируя холестерин, что приводит к соответствующемууменьшению эффективной концентрации холестерина в свободном от сигма-1рецептора бислое и увеличению эффективной концентрации холестерина в сигма1-богатых липидных кластерах.Следует отдельно отметить, что в FRAP-эксперименте измерялись некоэффициенты диффузии меченого холестерина, а фосфолипидов липидного- 90 -бислоя, что свидетельствует о том, что рецептор сигма-1 обладает способностьюхолестерин-зависимо модулировать физико-химические свойства мембраны(такие как вязкость).Рис.
18. Результаты FRAP-измерений коэффициента диффузии метки NBD-ФХ влипосомах различного состава в присутствии и отсутствии рецептора сигма-1.3.3.5 Рецептор сигма-1 локализуется в особых областях ЭРНа следующем этапе была исследована внутриклеточная локализациярецептора. Для этого были получены генетические конструкции, кодирующиебелок слияния S1R с зеленым флуоресцентным белком GFP (S1R-GFP).Конструкции были ко-трансфецированы в клетки линии HEK293 вместе смаркером эндоплазматического ретикулума mCherry-KDEL. Препараты былиисследованы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Каквидно на рис. 19, флуоресцентный белок локализуется в определенных областяхЭР, а не диффузно распределен в тубулах ЭР. Подобная локализация может бытьобъяснена следующим образом: белок может удерживаться в данных областяхпосредством белок-белковых взаимодействий, либо обладать сродством к одномуиз типов липидов, которыми богаты данные области.- 91 -Рис.
19. Внутриклеточная локализация сигма-1 рецептора дикого типа. Клетки линии HEK293Tбыли ко-трансфецированы плазмидами, кодирующими флуоресцентно-меченый S1R-GFP имаркер ЭР mCherry-ER.3.3.6 Определение консенсусной последовательности связывания стеролов ицерамидовВ предыдущих биофизических экспериментах было показано прямоевзаимодействие рецептора с компонентами липидных рафтов. С целью поискаструктурных аминокислотных последовательностей, которые могут отвечать засвязывание с липидами нами была проанализирована первичная аминокислотнаяпоследовательность рецептора сигма-1.
После выравнивания 15 аминокислотныхпоследовательностей рецептора сигма-1 млекопитающих, был осуществлен поискконсенсусных мотивов в программе Seq2Logo (рис. 20) [219]. Нами былосуществлен поиск участков, содержащих широко известные холестеринсвязывающие последовательности CARC (консенсус K/R-X1-5-Y/F/W-X1-5-L/V) иCRAC (консенсус L/V-X1-5-Y/F/W-X1-5-K/R) [220-222].На настоящий момент в литературе описаны два потенциальных сайтасвязывания стеролов в регионе Y176 и Y201-Y206 рецептора сигма-1 (рис.
20 Б иВ) [223]. Однако, оба сайта находятся в С-концевой области рецептора внетрасмембранного участка или примембранных областей [154]. В результатеанализа а.к. последовательности было предположено наличие еще одногоконсервативного сайта связывания холестерина в составе трансмембранногодомена в регионе R7-W10 (рис. 20 А), который содержал в себе четыреперекрывающихся CARC-мотива. Кроме того, была найдена консенсуснаяпоследовательность связывания церамидов на С-конце трансмембранного участка- 92 -(в регионе 28-32 а.к.о, соответствующая консенсусной последовательностисвязывания церамидов).Рис. 20.
Поиск консенсусных последовательностей связывания с холестерином. А. CARCмотивы в трансмембранном участке рецептора сигма-1 (а.к. остатки CARC подчеркнуты,трансмембранная спираль рецепторп обозначена красным цветом) Б. CRACпоследовательность в районе Y173 (а.к. остатки подчеркнуты). В. CRAC-последовательности врегионе Y201-Y206 (а.к. остатки подчеркнуты).3.3.7 Мутантные по сайту связывания холестерина формы рецепторасигма-1 диффузно распределены в тубулах ЭРДля проверки гипотезы о наличии сайта связывания холестерина в составепервого трансмембранного участка, были получены генетические конструкции,имеющие следующие замены в а.к.
последовательности белка: R7ER8E, deltaRR,AAAA, GGGG, а также WW (табл. 3).- 93 -Табл. 3. Мутантные формы рецептора сигма-1 по предполагаемому сайтусвязывания с холестериномНазвание мутантаА.к. последовательностьN-концевой областиWT – дикий тип1-MQWAVGRRWAWAALLLRR (R7ER8E)1-MQWAVGEEWAWAALLLdeltaRR1-MQWAVG--WAWAALLLAAAA1-MQWAVGRRAAAAWAWAALLLGGGG1-MQWAVGRRGGGGWAWAALLLWW1-MQWAVGRRLALAALLLМутации RR, deltaRR и WW были внесены с целью элиминации сайтасвязывания холестерина, в то время как тетрааланиновая или тетраглициноваяинсерции были внесены с целью разобщения критических для связыванияхолестерина а.к.о. Данные конструкции были ко-трансфецированы в клеткилинии HEK293T вместе с флуоресцентным маркером ЭР mCherry-KDEL (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
