Диссертация (1144259), страница 15
Текст из файла (страница 15)
13 А). Такимобразом, для дальнейших исследований была использована конструкция Htt-82QGFP, при трансфекции которой агрегаты наблюдались примерно в 40% клеток.Для того, чтобы оценить анти-агрегационные свойства синтезированногосоединения HNP1, вещество добавлялось в диапазоне концентраций 0.1-50 мкМ вкультуральную среду спустя 4 часа после трансфекции вектором Htt-82Q-GFP.- 80 -Покровные стекла были зафиксированы спустя 72 часа после трансфекции (рис.12). Было показано, что добавление пептоида HNP1 в концентрации 10 мкМ ивыше приводило к двухкратному уменьшению числа клеток, содержащихагрегаты хантинтина (38±5% 0 мкМ, 17±5% 50 мкМ HNP1,p<0.0001), чтосвидетельствует о том, что HNP1 обладает анти-агрегационными свойствами invitro (рис.
13 Б и В).Рис. 13. Агрегация флуоресцентно-меченого хантингтина in vitro и антиагрегационныесвойства пептоида HNP1. А. Пример агрегации полиГ-удлиненного хантингтина в клеткахлинии HEK293T. Клетки были трансфецированы вектором, кодирующим белок слиянияпервого экзона хантингтина (17Q или 138Q) с флуоресцентным белком GFP. Внутриклеточныеагрегаты показаны стрелками.
Б. Антиагрегационные свойства пептоида HNP1. Клетки,экспрессирующие белокслиянияHtt82Q-GFPкультивировалисьвприсутствиесоответствующих концентраций HNP1, после чего был вычислен процент клеток, содержащихядерные или цитоплазматические агрегаты хантингтина.3.2.4 N17-связывающий пептоид HNP1 предотвращает потерюсинаптических контактов в клеточной модели болезни ХантингтонаРанее нами было показано, что в смешанных кортико-стриатальныхкультурах клетки стриатума, полученные от мышей, мутантных по генухантингтина,формируютменьшееколичествосинаптическихконтактов(дендритных шипиков) по сравнению с нейронами, полученными от мышейдикого типа [215]. На 19-й день культивирования in vitro было показано, что вмутантных культурах происходит элиминация шипиков по сравнению скультурами дикого типа того же “возраста”.
Подобное наблюдение было ранее- 81 -опубликовано сотрудниками нашей лаборатории. Таким образом, даннаямодельная система может быть использована для оценки нейропротекторныхсвойств соединений in vitro.С целью исследования влияния пептоидного соеднения HNP1 наплотность шипиков анализировалось по семь нейронов из двух кортикостриатальных культур дикого и мутантного типов: в них было подсчитаноколичество шипиков и оценена их морфология. Подсчёт шипиков осуществлялсяна 19-й день культивирования in vitro (DIV 19).
Вещество добавлялось на 7-й денькультивированияinvitro.Дляоценкиморфологиииподсчетачисласинаптических контактов культуры на 19-й день культивирования фиксировали ииммуноцитохимическимаркерногобелкаокрашивалисреднихантителамишипиковыхпротивнейроновспецифическогостриатумаDARPP32.Изображения получали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе,после чего для подсчета числа шипиков и оценки их морфологии изображенияанализировали в программе NeuronStudio.Было обнаружено, что в присутствии HNP1 в концентрации 20 мкМ вкультурах мутантного типа (YAC128) восстанавливается плотность и морфологияшипиков до характеристик культур дикого типа (WT) того же возраста. Однако,плотность шипиков культур дикого типа при том же воздействии не изменяется(Рис. 14). Плотность шипиков культур дикого типа в присутствии 20 мкМ HNP1такженеизменяласьсвидетельствуютвпосравнениюпользутого,нейропротекторным эффектом in vitro.счтоконтролем.соединениеДанныеHNP1результатыобладает- 82 -Рис.
14. Нейропротекторные свойства пептоида HNP1 в смешанных кортико-стриатальныхкультурах нейронов. А. Изображения дендритов клеток стриатума, окрашенных антителамипротив DARPP32. Б. Количественный анализ линейной плотности дендритных шипиков вкультурах дикого типа и YAC128 в присутствии и отсутствии соединения HNP1 (N=2).3.2.5 ЗаключениеВ данной части работы были идентифицированы и синтезированыпептоидные соединения, связывающиеся с N-концевым доменом хантингтина,среди них – соединение HNP1. Была доказана специфичность взаимодействия сучасткомN17хантингтинапродемонстрировано,чтоиHNP1измеренаподавляетконстантасвязывания.внутриклеточнуюБылоагрегациюмутантного хантингтина в культуре клеток HEK293T. В заключение, былопоказано, что HNP1 является нейропротектором, способствующим сохранениюнормальнойплотностисинаптическихконтактоввкультурахполученных от мышей, экспрессирующих мутантный хантингтин.нейронов,- 83 -3.3 Белок-липидные взаимодействия рецептора сигма-13.3.1 Выделение и очистка рекомбинантного рецептора сигма-1 человекаДля биофизических исследований белок-белковых и белок-липидныхвзаимодействий требуется получение миллиграммовых количеств чистогорекомбинантного белка.
Зачастую, некоторые эукариотические белки не могутбыть эффективно экспрессированы в простых бактериальных и дрожжевыхсистемах экспрессии, что обусловлено неправильным фолдингом и отсутствиемпостр-трансляционных модификаций. Особенно часто плохая растворимость илинеправильное сворачивание наблюдаются при продукции белков, содержащихтрансмембранные домены.Таким образом, на одном из первых этапов работы был разработан протоколэкспрессии и очистки рекомбинантного сигма-1 человека. Клетки насекомыххорошо подходят для продукции белков, гетерологическая экспрессия которых недостигается в прокариотических клетках. Кроме того, в клетках насекомыхосуществляяются большинство пост-трансляционных модификаций белков.
Прииспользовании бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых Sf9 вкачестве продуцентов был достигнут высокий уровень экспрессии целевого белка.Для этого был получен вектор pFastBac, содержащий ген-вставку рецепторасигма-1ипредшествующуюемуN-концевуюполигистидиновуюпоследовательность. Путем рекомбинации в клетках E. coli DH10Bac былаполучена бакмида, содержащая ген-вставку. Бакмиды были трансфецированы вклетки линии Sf9 и получен рекомбинантный вирус для экспрессии белка. Послеэкспрессии в течение 72 часов клетки были собраны и лизированы вгипотоническом буфере, после чего была выделена мембранная фракция.Мембранные белки были экстрагированы с помощью детергента LDAO ихолестерина(1,0%+0,1%,соответственно).Последующиеэтапыочисткивключали в себя металл-хелатную хроматографию на Ni-NTA агарозе (рис.
15 А),анионоонообменную хроматографию на monoQ-смоле и гель-фильтрацию наносителе Superdex200 (рис. 15 В). Все буферные растворы также содержали 0,1%- 84 -фосфатидилхолинов яичного белка, в отсутствие которых белок не элюировался сгель-фильтрационной колонки в виде гомогенного пика. Согласно данным гельфильтрационной хроматографии молекулярная масса белка была 100-120 кДа, чтосоответствует тетрамеру рецептора сигма-1 (рис.
15 В), в качестве стандартаиспользовался бычий сывороточный альбумин (BSA) (мономер 67 кДа, димер 130кДа). На заключительном этапе для биофизических экспериментов белок былковалентно мечен по остатку лизина K142 и N-концевой аминогруппе с помощьюфлуорофора NHS-Alexa555. Чистоту белка, составившую >95%, определяли спомощью электрофоретического анализа с последующей окраской Кумасси(рис. 15 ).Рис. 15. Выделение и очистка рекомбинантного рецептора сигма-1 человека.
А. Выделениемембран и очистка с помощью металл-хелатной хроматографии. Соответствующие фракцииобозначены, окраска Кумасси. Б. Очистка с помощью анионообменной хроматографии и гельфильтрации. Окраска Кумасси. В. Профиль гель-фильтрации выделенного белка приразделении на колонке Superdex 200 10/300. Фиолетовый – рецептор S1R, красный – стандартBSA.- 85 -3.3.2 Рецептор сигма-1 взаимодействует с компонентами липидныхрафтов: холестерином и сфингомиелинамиИзвестно,ассоциированныечтоопределенныеконтактныесмитохондриямимембраны,областиЭР,характеризуютсявключаяособымлипидным составом [180, 216, 217].
Существует ряд доказательств в пользусуществования холестерин- и сфингомиелин-богатых рафтовых микродоменов вэтих областях ЭР. Нами были проведены эксперименты pull-down по связываниюрекомбинантного очищенного рецептора сигма-1 человека и общего клеточноголизата с холестерин-агарозой. Было показано, что как рекомбинантныйвыделенный белок, так и эндогенный рецептор сигма-1 способны связываться схолестерином, иммобилизованным на агарозном носителе (рис. 16 А). В качествеположительного контроля использовался холестерин-связывающий ферментACAT1.
Для доказательства специфичности взаимодействия использоваласьсмола с другим иммобилизованным стеролом – прогестероном, связывания скоторой в случае рекомбинантного рецептора не наблюдалось (рис. 16 А, нижняяпанель).В другом эксперименте, рецептор встраивался в липосомы различноголипидного состава. Одинаковое количество рецептора было реконструировано влипосомы, полученные из чистого липида ДОФХ и липосомы с включениемсфингомиелинов.
Как видно из рис. 16 Б, рекомбинантный S1R предпочтительносвязывался с липосомами, содержащими сфингомиелины, чем с липосомами,полученными из чистых фосфолипидов (рис. 16 Б).- 86 -Рис. 16. Эксперименты pull-down c холестерин-агарозой и липосомный pull-down.
А.Результаты pull-down эксперимента с холестерин-агарозой. Панели сверху вниз: связываниерекомбинантного очищенного рецептора (окраска Кумасси), связывание эндогенного рецептора(окраска антителами против сигма-1 рецептора), связывание ацетил-коА-ацетилтрансферазы(положительный контроль), отсуствие связывания рекомбинантного рецептора с прогестеронагарозой. Б. Липосомный pull-down рецептора сигма-1 различными липидными смесями.Окраска антителами против рецептора сигма-13.3.3 Реконструкция рецептора сигма-1 в липидные бислои.
Кластеризациярецептора в холестерин-содержащих липосомахДля прямых биофизических исследований in vitro была разработанаоригинальная методика реконструкции рекомбинантного рецептора сигма-1человека в модельные бислойные мембраны (липосомы). В работе длявстраивания рецептора в липидные бислои использовались следующие липиды:1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин 18:1 (ДОФХ), сфингомиелины головного- 87 -мозга, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин 16:0 (ДПФХ), холестерин(Avanti Polar Lipids).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
