Диссертация (1141476), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Тест выполнялся по методике,41описанной в [127] и заключался в определении диспергированныхвзвешенных веществ в надиловой жидкости после 30 минут отстаивания,определении флокулированных взвешенных веществ в надиловой жидкостипосле 30 минут предварительной обработки в флокуляторе (30 минутперемешиванияпричастотевращениялопастейперемешивающегоустройства флокулятора 50 Гц) и определении концентрации взвешенныхвеществ в очищенной сточной воде после вторичного отстаивания.Для исследования механизма возникновения и поддержания встабильномсостоянииденитрификациипроцессабылпроведенодновременнойряднитрификациимикробиологическихиигидробиологических исследований, включающих, в том числе, исследованиефлокул активного ила.Гидробиологические и микробиологические исследования проводилисьметодами оптической и растровой электронной микроскопии, а такжемолекулярно-генетическими методами (ПЦР-анализ).
Флокулы активногоила исследовались микроскопированием и методом лазерной дифракции,позволяющим определить распределение размеров флокул.Для оценки потенциала микробного сообщества активного ила косуществлениюпроцессовнитрификациииденитрификациибылиспользован метод ПЦР в реальном времени (количественная ПЦР), спомощью которого было измерено количество генов, кодирующих ключевыеферменты азотного цикла — amoA (фермент аммониймонооксигеназа),который осуществляет первый этап окисления аммиачных форм азота. nirK,nirS (две разных нитритредуктазы). Также для характеристики микробныхсообществ образцов активного ила было оценено количество рибосомальныхгенов бактерий и архей. Исследования проводились на базе Почвенногоинститута имени В. В.
Докучаева.Объектами исследования являлись образцы активного ила, отобранныенаразныхэтапахлабораторногоисследованияприразличныхтехнологических параметрах работы экспериментальных установок. Помимо42этого, были отобраны образцы активного ила с действующих очистныхсооружений, работающих по технологической схеме одноиловой денитринитрификации.После отбора пробы активного ила подвергались центрифугированиюпри скорости 10 000 об/мин для концентрирования биомассы и последующейзаморозке для хранения.Выделение общей ДНК из каждой пробы проводилось в двухкратнойповторности для последующего независимого анализа.
ДНК выделялось припомощи набора MPBio FastDNA Spin Kit for Soil согласно протоколу.Дополнительнопроводиласьобработканавортексе.Гомегенизациявыполнялась в гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies).В результате выполнения протокола ДНК переводилась в раствор ибыла пригодна к использованию для ПЦР и других методов анализа.Сохранялась возможность длительного хранения при -20°C или при 4°C доиспользования.В исследовании методом количественной ПЦР (ПЦР-Real Time) былооценено количество копий рибосомальных генов бактерий и архей вобразцах, а также количество копий функциональных генов связанных снитрификацией (amoA) и денитрификацией (nirK, nirS).
Оценка генов 16Sрибосомальной РНК бактерий и архей осуществлялась в амплификатореiCycler (Biorad). Смесь готовилась из буферов для количественной ПЦР (×2БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue, Биолабмикс), добавлялась ДНК-матрица вобъеме 1 мкл (экстрагированной, согласно протоколу, ДНК) и по 0,5 μМольпраймеров. Для амплификации консервативных участков ДНК бактерий (16SrRNA) использовали праймеры Eub338 и Eub518 [57] для 16S rRNA архей 915f и 1059r.ВкачествестандартовдляпроверкиэффективностиПЦРиопределения количества генов были использованы растворы с известнойконцентрацией генов 16S rRNA Esherichia coli (для бактерий) и штамма FG07 Halobacterium salinarum (для архей).43Такжебылооцененоколичествофункциональныхгенов,ассоциированных с двумя процессами азотного цикла. Реакционная смесьготовилась аналогично, концентрация праймеров составляла 0,8 μМоль.
Дляамплификации генов, ассоциированных с процессом нитрификации, былииспользованы праймеры amoA-1F и amoA-2R на бактериальный amoA [69] иArch-amoAF и Arch-amoAR на архейный amoA. В качестве стандартов длябактериального amoA был использован продукт амплификации ДНК,выделенной из почвы. ПЦР-продукт был очищен, его концентрацияоценивалась с помощью прибора Qubit fluorometer 2.
Для архейного amoA небылоиспользованостандартов,поэтомуегоопределениебылокачественным, а не количественным.Для амплификации и оценки количества генов, ассоциированных спроцессом денитрификации, были выбраны следующие праймеры: nirK876 иnirK1040 для nirK [69], cd3af и R3cd для nirS [101; 125]. Эти гены кодируютразные ферменты, обеспечивающие денитрификацию. В качестве стандартовбыли взяты продукты амплификации ДНК, выделенные из культурSinorhizobium meliloti (для nirK) и Pseudomonas sp (для nirS).
Нуклеотидныепоследовательности использованных праймеров представлены в таблице 2.2.Таблица 2.2 – Перечень использованных праймеровЦелевая группаили процессЦелевой генНазваниепраймераPrimer sequence (F, R)Бактерии16S rRNAEub338Eub518ACTCCTACGGGAGGCAGCAGATTACCGCGGCTGCTGGEsherichia coli(Fierer et al.,2005 [57])Археи16S rRNA915f1059rAGGAA TTGGC GGGGGAGCACGCCAT GCACC WCCTC Tштамм FG-07Halobacteriumsalinarum(Margulies etal., 2005 [98])НитрификацияБактериальный amoAamoA-1FamoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCSoil(Hallin et al.,2009 [69])АрхейныйamoAArch-amoAFGCTCTAATTATGACAGTATACAYCATGTTGAAYAATGGTAATGACнет(Park et al.,2008 [107])ATY GGC GGV CAY GGCGAGCC TCG ATC AGR TTRTGG TTSinorhizobiummeliloti(Hallin et al.,2009 [69])Arch-amoARДенитрификацияnirKnirK876nirK1040Standard sourceСсылка44nirSПроцедурыcd3afR3cdGTSAACGTSAAGGARACSGGGASTTCGGRTGSGTCTTGAамплификациигенов16SPseudomonas sprRNA(Michotey etal., 2000 [101];Throbäck et al.,2004 [125])(бактериальных,архейных), ПЦР в реальном времени для генов amoA (бактериальных,архейных), ПЦР в реальном времени для генов nirK, nirS проводились попротоколам, включающим в себя во всех случаях предварительнуюденатурацию ДНК, денатурацию двухцепочечной ДНК, отжиг праймеров наматрице, удлинение цепи ДНК и считывание значений флуоресценции.Для оценки специфичности продукта во всех случаях проводилсяанализ кривой плавления от 65 °С до 95 °С с шагом в 0,5 °С.Количество изученных генов в образцах определялось с помощьюпрограммного обеспечения CFX Manager (Bio-Rad).
Из стандартныхрастворов с известной концентрацией были приготовлены разведения (от 108до 103 копий/мкл). По результатам амплификации стандартных растворовбыл построен калибровочный график (во всех случаях R2 > 0,95), которыйиспользовался для определения количества генов в препаратах ДНК,экстрагированных из биомассы активного ила.
Эффективность реакций ПЦРварьировалась в допустимых пределах 80-100%. Пересчет на количествокопий генов на грамм субстрата проводился с учетом исходной навески.Определениеразмеровфлокулактивногоилаприразличныхтехнологических режимах на разных этапах эксперимента выполнялосьметодом лазерной дифракции.Сутьметодазаключаетсявиспользованиидифракцииэлектромагнитных волн. Параллельный лазерный луч, проходя черезчастицу, преломляется и отклоняется на величину угла, зависящую отсвойств частиц (в том числе диаметра). Система линз фокусирует рассеянныйпреломленныйсветвместеустановкидетектора,измеряющегораспределение световой энергии. В соответствии с теорией Фраунгофера,используя комплекс математических методов, вычисляется распределениеразмера частиц.45ДлявыполненияанализаиспользовалсяприборAnalysette22(FRITSCH), позволяющий определять распределение размера частиц всуспензиях, которыми являются образцы подготовленной иловой смеси.При подготовке пробы был проведен подбор режима ультразвуковогодиспергирования для разделения отдельный флокул активного ила безразрушения их собственной структуры.
В качестве лазера использовалсятвердотельный лазер (15 мВт; λ=635 нм). Эксперименты проводились приобеспечении температуры 20 °С. Коэффициент диффузии находился вдиапазоне от 10-6 до 10-9 см2/сек.Гидробиологический анализ активного ила в ходе проведенияисследования продемонстрировал влияние скорости потока на насыщениеиловой среды кислородом воздуха и поддержание благоприятных условийдля существования индикаторных микроорганизмов. Гидробиологическийанализ выполнялся по этапам.
При низких концентрациях кислорода вбиореакторе была отмечена активность тех микроорганизмов, которыеобычно при нехватке кислорода активности не проявляют.Анализы производились по живой капле. Для пробы были отобраны 5капель для рассмотрения под покровным стеклом, в каждой были изучены 40видовыхполейдляколичественногоопределенияиндикаторныхмикроорганизмов с увеличением 100х. Для качественного определениясостояния организмов и их активности использовалось увеличение 400х.При гидробиологическом анализе проб активного ила проводиласьоценкаследующиххарактеристик ииндикаторных микроорганизмов(количество по 9 балльной шкале и активность):1.
Визуальная характеристика пробы (структура и цвет активного ила,прозрачность надиловой воды (концентрация взвешенных веществ всупернатанте (DSS));2. Наличие и количество нитчатых бактерий. Гидробиологическийанализ активного ила с целью отслеживания и контроля развития нитчатых46микроорганизмов производился по методике ПНД Ф СБ 14.1.92-96 [34] ссоответствующей классификацией;3.
Аспидиски Aspidisca costata и Aspidisca sulcata — в нормальнофункционирующем активном иле присутствуют почти всегда в большомколичестве;4. Инфузории отряда Peritricha (Vorticella convallaria, Operculariacoarctata и др.) — чувствительны к кислородным условиям, характеризуютдиффузию кислорода из воды в активный ил;5. Инфузории Litonotus lamella — присутствует в активном иле привысоких удельных нагрузках по органическим загрязнениям и принарушениях стабильности системы;6.Коловраткичувствительнык(Philodina,кислороднымMonostyla,условиям,Notommataхарактеризуютидр.)—диффузиюкислорода из воды в активный ил;7.
Малощетинковые черви Aeolosoma — наличие малощетинковыхчервей говорит об осуществлении процессов нитрификации в аэротенкахлибо о низкой нагрузке.Растровая электронная микроскопия использовалась для исследованияфлокул активного ила. Образцы постепенно высушивались на мембране,далее помещались на проводящий материал и исследовались в режименизкого вакуума на растровом электронном микроскопе Quanta FEI 250 приразгоняющем напряжении 10 кВ.2.3. Результаты лабораторных исследований на модельной жидкости2.3.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
