Диссертация (1141216), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Распределение всех пациентов по количествуCD4+ отражено в рис.4А, пациентов из первой группы в рис. 4Б, пациентов извторой группы в рис. 4В.Рисунок 4А. Распределение всех пациентов в зависимости от уровня CD4+лимфоцитов в периферической крови.33Рисунок 4Б. Распределение пациентов первой группы в зависимости отуровня CD4+ лимфоцитов в периферической крови.Рисунок 4В. Распределение пациентов первой группы в зависимости отуровня CD4+ лимфоцитов в периферической крови.34Одним из наиболее информативным показателем состояния иммуннойсистемы у ВИЧ инфицированных пациентов считается иммунорегуляторныйиндекс.Рисунок 5.
Показатели иммунорегуляторного индекса у обследуемыхпациентовНа рисунке 5 продемонстрировано снижение у всех обследованныхпациентов уровня иммунорегуляторного индекса CD4\8 менее 1,5, что являетсяпоказателем высокого риска возникновения оппортунистических заболеваний иявляетсякритериемназначенияантимикробныхпрепаратовдляихпрофилактики, а также является одним из показателей, необходимых дляустановлениястадииВИЧ-инфекции.Показательмедианыиммунорегуляторного индекса составил 0,175 (min 0 max 2,26) (со среднимзначением 0,399) в 2017г.
и 0,23 (min 0 max 1,28) (со средним значением 0,318) в2015г., что также является показателем однородности обследуемых пациентов вотношении выраженности иммуносупрессии.35В соответствии с общепринятыми критериями [135] (количество CD4+ ииммунорегуляторный индекс), принимая во внимание совокупность клиниколабораторных данных, стадию ВИЧ-инфекции 3 (субклиническую) имели 2%пациентов; 4А -10% пациентов, стадию 4Б -8% и подавляющее большинство–стадия 4В-80% [рис.6] (79% в 2015г.
[рис.7] , 80% в 2017г [рис.8]).Рисунок 6. Распределение ВИЧ-инфицированных пациентов по стадиямзаболевания.36Рисунок 7. Распределение ВИЧ-инфицированных пациентов по стадиямзаболевания в 2015г.Рисунок 8. Стадии ВИЧ-инфекции у обследуемых пациентов в 2017г.Все пациенты, включенные в исследование, исходно были обследованы на37наличие в крови маркеров вирусных гепатитов с помощью коммерческихтест-системсиспользованиемИФА(анализаториммуноферментныйавтоматический "Еволис") и определения anti-HBcore IgM, IgG, anti-HBs, antiHBe,anti-HCV IgM, IgG, anti-HDV IgM, IgG.ХВГС был диагностирован у 65% пациентов, включенных в исследование,ХВГВ - у 4%, ХВГВ+ХВГС у 2%. Распределение пациентов в зависимости отэтиологии вирусных гепатитов представлено на рис.
9.Рисунок 9. Распределение пациентов в зависимости от этиологии вирусныхгепатитовБыли использованы стандартные и дополнительные методы обследованияВИЧ-инфицированных пациентов, согласно приказу Минздравсоцразвития РФ от9 июля 2007 года № 474.В частности, при обследовании пациентов были диагностированызаболевания, вызванные Candida spp. различной локализации. Кандидозный38эзофагит был выявлен у 63% пациентов, грибковый колит у 2%, себорейныйдерматит у 12% [рис.10].Рисуноксоответствии10.сРаспределениеналичиемВИЧкандидозногоинфицированныхэзофагита,пациентовгрибковоговколита,себорейного дерматита.Из включённых в исследование пациентов с ВИЧ, у 78% были выполненыследующие исследования:Диагностика оппортунистических инфекций методом ПЦР на основанииисследования мокроты, включая ВЭБ ЦМВ, ВГ 6 типа, ВПГ1,2 типа, MБТ,Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis (прибор дляпреаналитическойподготовкиПЦР-анализов"КобасАмплиПреп"КобасАмплиПреп, анализатор "Кобас ТакМан 48", прибор для преаналитическойподготовки ПЦР-анализов "Кобас АмплиПреп", анализатор для проведения ПЦРAbbott m2000rt 9K 1501, прибор m2000 04J72-01 Abbott Molecular).
Полученныерезультаты отражены на рисунке 11. Таким образом, C. Albicans была обнаруженву 34,69%, C. glabrata у 16,32%, C. kruseiу8,16%пациентов,поданным39лаборатории КИБ №2 [рис.11].Рисунок 11. Частота выявления генетического материала возбудителейоппортунистических инфекций у обследованных пациентов с ВИЧ инфекцией.Анализ полученных результатов выявил преимущественное присутствиеВЭБ, ЦМВ, C. Albicans, C. Glabrata в различных сочетаниях [диаграмма 1], чтосоответствуетлитературнымданнымповыявлениюоппортунистическихинфекций у ВИЧ инфицированных пациентов в зависимости от числа CD4+.Наличие ВЭБ инфекции и кандидоза у вошедших в исследование пациентовкоррелировало с уровнем СД4 <200 кл.40Диаграмма 1. Частота выявления различных сочетаний генетическогоматериалавозбудителейоппортунистическихинфекцийу обследованныхпациентов с ВИЧ инфекцией.Рентгенографическое исследование органов грудной клетки выявилопневмонию у 56% обследованных пациентов [рис.
12], но только у 8% былаподтверждена методом ПЦР пневмоцистная пневмония (прибор m2000 04J72-01Abbott Molecular). Туберкулез не был установлен ни у одного из пациентов,вошедших в исследование.41Рисунок 12. Распределение ВИЧ инфицированных пациентов в зависимостиот наличия или отсутствия подтверждённой пневмонии.Биохимический анализ крови (10 параметров: общий белок, альбумин,биллирубин общий, АЛТ, АСТ, глюкоза, мочевина, креатинин, щелочнаяфосфатаза, амилаза) проводили на автоматическом биохимическом анализатореARCHITECT c8000 Abbott.
Отклонение от нормы установлено по следующимпараметрам: превышение нормальных показателей общего биллирубина у 24,48%,АЛТ 40,81%, АСТ 57,14%, глюкозы у 18,36%, мочевина у 14,28%, креатинина у12,24%, щелочной фосфатазы у 2,04%, амилазы у 22,45% обследуемых пациентов[рис. 13]. Преобладающими отклонениями являются увеличение активности АЛТ,АСТ, что может быть обусловлено наличием у большинства обследованныхпациентов хронических гепатитов различной этиологии.42Рисунок 13.
Отклонение от нормы различных показателей биохимическогоанализа крови у обследованных пациентов.23 из 48 пациентов была назначена АРТ в соответствии с российскимирекомендациями (Покровский В.В. и соавт., 2002-2012), что нашло отражение вповышении амилазы и глюкозы в связи с наличием реактивного панкреатита,ассоциированного с противовирусными препаратами.Приведённые клинико-лабораторные данные по обследованным пациентамс ВИЧ, подтверждают однородность и сопоставимость по основным показателямпациентов первой группы (исследование 2015г.)(исследование 2017г.).пациентам второй группы432.2 Характеристика специальных методов лабораторного исследованиямазков из ротоглотки и образцов фекалий на Candida spp. у обследованныхВИЧ-инфицированных пациентов.2.2.1 Лабораторные методы исследования культур Candida spp.,выделенных у ВИЧ-инфицированных пациентов.Для выделения культур Candida spp., образцы фекалий и мазков изротоглотки, полученные у ВИЧ-инфицированных пациентов засевали на кровянойагар при помощи тампона, материалы инкубировались в термостате 24 часа, притемпературе 37 С.После данного этапа производили, пересев на селективную среду Сабуро-2при помощи микробиологической петли и инкубировали в термостате на 24 часа,при температуре 37 С.
Идентификация проводилась с помощью различныхметодов, в том числе в целях их сравнения. Производилась микроскопия мазковиз культур, окрашенных по Граму. Была произведена оценка чувствительности кантимикотикамдиско-диффузионнымметодом.Такжебылипроведеныбиохимические исследования с помощью коммерческих тест-систем (Remel, ErbaLachema). Как контрольный метод видовой идентификации использоваласьмультиплексная ПЦР с видоспецифическими праймерами (Amplisens).В дальнейшем, полученные изоляты культивировались на КАНДИДАХРОМ АГАРЕ для дальнейшей дифференцировки, после инкубирования втермостате 24 часа, при температуре 37 С и производилась ориентировочнаядифференцировкагрибовпоцветуколоний,согласноинструкциикдифференциальной среде.
Полученные данные заносились в лабораторныйжурнал.ТакжепроизводиласьпостановкаПЦР-РВдляокончательнойдифференцировки штаммов Candida (Amplisens). Полученные данные заносилисьв лабораторный журнал. Выделенные чистые культуры Candida spp. хранили наскошенном агаре Сабуро в пробирках при температуре 4 – 60С.442.2.2 Идентификация Candida spp. методом ПЦР-РВ, «АмплиСенс C.albicans / C.
glabrata /C. krusei-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»Для выделения ДНК использовали двухдневные культуры Candida spp.ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:1.Для экстракции (выделения) ДНК использовались наборы реагентов,рекомендованныеФБУНЦНИИЭпидемиологииРоспотребнадзора[фотография 3], в соответствии с инструкцией к используемому набору.Экстракция ДНК из каждого клинического образца проводилась вприсутствиииспользованиивнутреннегоформконтрольноговыпусканабораобразца4-7для–ВКО-FL.экстракцииПриДНКиспользовался входящий в набор комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ».Фотография 3. Биохимическая тест-система для видовой идентификациидрожжеподобных грибов Remel.2.
Амплификация проводилась с флуоресцентной детекцией в режиме45«реального времени» с помощью комплекта реагентов «ПЦР-комплект»вариант FRT-100 F [фотография 4, 5, 6].Фотография 4. Центрифуга для планшета для ПЦР.46Фотография 5. Приготовление рабочей смеси для проведения ПЦР длявыделения ДНК Candida.47Фотография 6. Внесение образцов для проведения ПЦР.3.отсутствия)Результатыинтерпретировалисьпересечениякривойнаоснованиифлуоресценциисналичияустановленной(илинасоответствующем уровне пороговой линией, что определялост наличием (илиотсутствием) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» всоответствующейграфевтаблицерезультатов[фотография7].48Фотография 7.
График с результатами ПЦР.Детальная информация по процедуре проведения ПЦР-исследования взависимости от типа используемого оборудования изложена в методическихрекомендациях ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора «Исследованиеклинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и другихинфекцийоргановрепродукцииметодомПЦРсгибридизационно-флуоресцентной детекцией».2.2.3 Идентификация Candida spp. методом INTEGRAL SYSTEMYEASTS plus.INTEGRAL SYSTEM YEASTS plus – 24 луночная система, содержащаябиохимические субстраты и высушенные противогрибковые вещества дляидентификации клинически важных дрожжей, а также оценки чувствительности49к противогрибковым препаатам.Идентификация основывалась на реакциях ассимиляции сахаров; тесты наассимиляционную реакцию интерпретируются оценкой изменения цвета влунках [фотография 8, 9].Фотография 8. Проведение идентификация Candida spp.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
