Диссертация (1141130), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Тканевая инженерия кости предлагает перспективныеподходы для создания костезамещающих материалов и имплантатов сконтролируемыми во времени остеоиндуктивными и остеогеннымисвойствами.Актуальность развития инженерии костной ткани отражена в научнойлитературе, так при анализе баз данных по ключевым слов «инженериякостной ткани» (bone engineering) получены следующие данные: e-library.ru– 37 221 источника (статьи, патенты), http://www.sciencedirect.com – 84 508,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed – 39 775, Google Scholar – 2 320 000,etc… .Благодарясовременномупрограммномуобеспечению,интегрирующему в себе возможность обработки данных компьютернойтомографиииисследователейвиртуальногоиклиницистовобъёмногопоявилась(3D)моделирования,возможностьупроводитькомпьютерное планирование реконструктивных операций и получатьмодели костных имплантатов полностью конгруэнтных воспринимающемуложе [Мураев А.А., Короткова Н.Л., 2013], т.е.
процесс подготовки моделиКИ для производства можно считать решённой задачей.В данной работе описана тканеинженерная терапевтическая системадля челюстно-лицевой хирургии, которая была разработана нами на основесозданных на прошлых этапах методах изготовления биокомпозитныхскэффолдов и метода введения в них МСК.В работе были использованы следующие материалы: поли-3оксибутират (ПОБ, М = 147 кДа), альгинат натрия (Сигма-Алдрич,95Германия), трихлорметан (EKOS-1, Russia), карбонат аммония (Химмед,Россия), сахароза (Химмед, Россия), гидроксиапатит (Сигма-Алдрич,Германия), стрэнг из полилактида для 3D печати методом послойногонаплавления (температура плавления 200-255 °С, плотность 1,08-1,2 кг/м2),(Московский завод FDPlast, Россия).Исследование включало три этапа.
На первом этапе проведенаразработка полимерного каркаса - матрикса из поли-3-оксибутирата (ПОБ икомпозита ПОБ/ГА), исследование его in vitro на цитотоксичность испособность поддерживать рост клеток и in vivo на мягкие ткани ибедренной кости крыс на биосовместимость. Затем на втором этапе былиотработаны новые методики операции и проведено экспериментальноеисследование критических дефектов на черепах крыс с применениемматриксов из ПОБ. В итоге на третьем этапе проведено экспериментальноеисследование критических дефектов на черепах крыс с применениемкостного каркаса из ПОБ совместно с МСК – тканеинженернойтерапевтической системы.Наоснованиитканеинженернойполученныхтерапевтическойранееданныхсистемыдлядляизготовлениячелюстно-лицевойхирургии был выбран скэффолд из ПОБ/ГА/АЛГ.Для первой стадии изготовления биокомпозитного скэффолда изПОБ/ГА/АЛГ был использован разработанный ранее модифицированныйметод выщелачивания, в котором использовались не один, а два видапорообразователя: карбонат аммония ((NH3)2CO3) и сахароза (C12H22O11)[Мураев А.А., Бонарцев А.П., Стамболиев И.А., 2016; Kuznetsova E.S.,Zharkova I.I., 2016].
Все эксперименты проводили в стерильных условиях вламинарном шкафу. Для создания пор, оптимальных для культивированияклеток, сахарозу и карбонат аммония просеивали через специальныелабораторные сита У1-ЕСЛ (Крафт, Россия) с тканью из сетки по ГОСТ6613-86 и размером ячеек 40, 94 и 315 мкм: размер кристаллов карбоната96аммония составил 40-94 мкм, сахарозы – 94-315 мкм. Раствор ПОБ 65 мг/млв трихлорметане добавляли к смеси карбоната аммония и сахарозы (1:3) досостояния смеси близкому к жидкой пасте.
Для получения скэффолдов,содержащих гидроксиапатит (ГА), раствор ПОБ 65 мг/мл в трихлорметанедиспергировали совместно с ГА в концентрации 6,5 мкг/мл, т.е.соотношение ГА к ПОБ составляло 1:10. Такое соотношение было выбранона основании литературных данных и проведенных ранее исследований, какнаименее токсичное для МСК и при этом придающая скэффолдамостеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства [Blaker J.J.,2005; HuangY.X., 2008].Этой смесью заполняли форму, изготовленную ранее: 3D-форму.После испарения растворителя, форму погружали в горячую воду (~ 90 °С).Напервойстадииметодадвойноговыщелачиванияпроисходиттермическое разложение карбоната аммония ((NH4)2CO3 → 2NH3 + CO2 +H2O) – при этом образуются поры меньшего диаметра. При взаимодействиис водой и небольшом нагревании карбонат аммония полностью разлагаетсяс выделением аммиака и диоксида углерода, а сахароза переходит в воднуюфазу (вымывается).
Процесс образования газов происходит довольноактивно, поэтому пористость достигается не только в результате удаленияпорообразователя, но и за счет деформации полимера. После прекращениягазообразования полученные матриксы удаляли из формы и промывалидистиллированной водой 5 по 30 мин на шейкере, воду меняли несколькораз до полного вымывания сахарозы. В результате данной методики мыполучали трехмерные скэффолды с системой сообщающихся пор.МорфологическиеоксибутиратаТип скэффолдаС-ПОБС-ПОБ/ГАхарактеристикиПористость, %93 ± 192 ± 1матриксанаосновеРазмер пор, мкмМакропорыМикропоры410 ± 7523 ± 8365 ± 6518 ± 7поли-3-Связность пор++97Макропоры больше 300 мкм считаются оптимальным размером дляпроникновения питательных веществ и клеток во всем объеме матрикса[Karageorgiou V., Kaplan D., 2005].Методики изготовления биокомпозитных скэффолдов описаны встатьях и тезисах конференций, опубликованных в рамках настоящегоПроекта [Bonartsev A.P., Zharkova I.I., 2016; Мураев А.А., Бонарцев А.П.,Стамболиев И.А., 2016; Kuznetsova E.S., Zharkova I.I., 2016].Для введения МСК в биокомпозитные скэффолды, т.е.
собственно дляизготовления тканеинженерной конструкции была использованыа культураМСК крыс. МСК были выделены в нашей лаборатории из костного мозга 3х дневных крысят. Для этого бедренные кости крысят были извлечены иочищены от мягких тканей в стерильных условиях. Эпифизы бедренныхкостей были отрезаны и костный мозг был извлечен путем промываниякультуральной средой в объеме 5 мл при помощи шприца с иглой 27G.Извлеченные клетки инкубировали в среде DMEM (Dubecco’s ModifiedEagleMedium, Invitrogen, США) с коллагеназой I типа (215 Ед/мг белка) 1час при 37°C. После чего клетки центрифугировали 10 мин при 1000 об/мини осадок собирали в пластиковом культуральном флаконе на 25 мл. КлеткиобеихлинийкультивироваливсредеDMEM,содержащей10%эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (FCS, Biological Industries, Israel),100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, США).Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе MCO-15AC (Sanyo, Япония) при 37ºC в атмосфере, содержащей 5 % CO2, среда меняли каждые 3 дня.
Клеткиснимали с подложки раствором трипсина (0,05 % трипсин (Биолаб, Россия)в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (Serva, Germany) и подсчитывали спомощью гемоцитометра. Для эксперимента использовали МСК 3-егопассажа [Правдюк А.И., 2010].Для введения МСК в матрикс были выбраны матриксы изПОБ/ГА/АЛГ, в которых альгинатный гидрогель был использован в98качестве средства введения МСК в объем полимерного матрикса. Методвведения МСК в биокомпозитные скэффолды заключался в том, что настадии заполнения пористых скэффолдов из ПОБ/ГА/АЛГ, в скэффолдывводили МСК, предварительно помещенные в 1% альгинат натрия.Порошок альгината натрия (Сигма-Алдрич, Германия), стерилизованный вспирте и под ультрафиолетом, растворяли 6 часов при перемешивании намагнитной мешалке в физиологическом растворе в концентрации 1,5% встерильных условиях в ламинарном шкафу.
Затем готовили суспензию АЛГс клетками в концентрации 200 000 клеток в 1 мл суспензии (итоговаяконцентрация альгината составила 1,0%). Полученной суспензией спомощью автоматической пипетки пропитывали полученные на первойстадии скэффолды ПОБ/ГА по 100 мкл (20 000 клеток) суспензии на одинскэффолд. После пропитки удаляли лишний альгинат и заливалистерильным 50 мМ раствором CaCl2 для полимеризации альгинатногогидрогеля, содержащего клетки. После инкубации в течение 3 минут вхлориде кальция, матриксы промывали в фосфатном буфере и затемпомещали в среду для дальнейшего эксперимента.Полученная тканеинженерная система была использована дляисследования ее терапевтической эффективности на критическом дефектекостной ткани на лабораторных крысах in vivo.Для исследования регенерации костей черепа наиболее показательнойявляется модель критического дефекта свода черепа (теменной кости) укрысы [Spicer P.P., 2012], позволяющая получить воспроизводимые данныеи сравнить их с многочисленными результатами других исследований[Kundu J., 2013; Ivanov S.Y., Bonartsev A.P., 2015], нами проведено in vivoисследование критических дефектов черепа крысь породы Wistar весом до400 гр.
В эксперимента были использованны 40 крыс, которые разделены на4 групп по 10 животных в каждой группе.99Вгруппе№1(контрольная)уоперированныхкрыссозданкритический дефект 8мм и рана ушита наглухо. В группе №2 после созданиекритического дефекта имплантирован матрикс ПОБ с АЛГ. Аналогично вгруппе №3 матрикс ПОБ +АЛГ+ГА, в группе №4 матрикс ПОБ +АЛГ+ГА+МСК.Под внутрибрюшинным наркозом «Золетил 100» в дозировке 125мкг/кг крысам производили поперечный и вертикальный латеральносмещённый разрез кожи головы, формируя треугольный лоскут ипоследовательно, тупым и острым путём обнажали теменные кости.Посередине сагиттального шва на теменных костях формировали круглоеотверстие с помощью трепана С-reamer диаметром 8 мм из набораNeobiotech SLA (Корея), избегая перфорации сагиттального венозногосинуса.
Костный дефект заполняли изготовленным КИ, который отличалсянаполнением в каждой исследуемой группе. Рану послойно ушивали. Дляоценкидинамикиприжизненноенеоостеогенезатройноемечениенаразныхсрокахновообразованнойпроводиликостнойтканитетрациклиновыми красителями. Мечение осуществляли по схеме 7-3-4-34-3-4 (три дня введения (раствор доксициклина; раствор тетрациклина;ализарин красный С) чередовались с четырехдневными перерывами) вдозировке 25 мг/кг массы тела. Через месяц (28 дней) крыс подвергалиэфтаназии, материал отправляли на гистологическое исследование.Основываясь на данных исследования гистологических срезовобразцов костной ткани при помощи флуоресцентной микроскопии сраздельным окрашиванием флюорохромами было показано, что:1 группа с гибридный матрикс из поли-3-оксибутирата и альгинатаобладает ограничительной функцией, обеспечивая условия для нормальнойрегенерации плоских костей черепа у крыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
