Автореферат (1139916), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Результаты изучения влияния строения агликонов на биологическиесвойства этих гликопептидов предопределяют рациональные направления длядальнейшего поиска новых высокоэффективных производных МДП. Гликозиды МДПмогут найти применение в клинической практике инфекционистов, клиническихиммунологов и онкологов. Наиболее вероятными сферами использования данныхпрепаратовпредставляютсяпрофилактикаострыхирецидивовхроническихинфекционных заболеваний, повышение эффективности этиотропного лечения этихболезней, адъювантная иммунотерапия злокачественных новообразований и коррекциявызванныххимиотерапиейиммунныхигематологическихрасстройствуонкологических пациентов.Основные положения, выносимые на защиту1) β-Гликозиды МДП с алифатическими агликонами обладают большейбиологической активностью в сравнении с β-гликозидами МДП с циклическими итрициклическим агликонами; при этом увеличение числа атомов углерода с 7 до 12 валифатической цепи агликона приводит к снижению иммунотропной действенностисоединений в условиях моделей in vitro.2) β-Гептилгликозид МДП превышает по иммунотропной эффективности другиеизученные гликозиды МДП и при этом обладает сходной с немодифицированным МДПбиологической активностью по отношению к мононуклеарным лейкоцитам инейтрофилам крови человека in vitro.3) β-Гептилгликозид МДП увеличивает экспрессию молекул CD14 дендритнымиклетками человека in vitro.4)Внутрибрюшинноевведениеβ-гептилгликозидаМДПповышаетконцентрацию провоспалительных и регуляторных цитокинов в сыворотке кровимышей линии C57Bl/6, при этом в большинстве случаев β-гептилгликозид МДПпревосходит МДП по цитокин-индуцирующей активности.5) β-Гептилгликозид МДП при применении в терапевтическом режимеподавляетростподкожногоузлапривитойпродолжительность жизни мышей-опухоленосителей.6меланомыB16иповышаетСоответствие диссертации паспорту научной специальностиДиссертацияотвечаеткритериямформулыспециальности14.03.09–Клиническая иммунология, аллергология.
Проведенное исследование соответствуютразделу «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения ипрофилактикиаллергическихииммунопатологическихпроцессов»областиисследования, указанной в паспорте этой специальности.Методология и методы исследованияМетоды исследования включали в себя колориметрическое определениецитотоксическойактивностиNK-клеток,измерениефагоцитарнойактивностинейтрофилов и их фагоцитарного числа по отношению к частицам латекса.Определение экспрессии маркеров активации (CD1а, CD40, CD80, CD83, CD86,CD14,дендритнымиHLA-DR)клеткамичеловекаметодомпроточнойцитофлуориметрии.Измерение уровня цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-a, GMCSF, IL-4) в сыворотке крови мышей линии C57BL/6 при помощи системыFlowCytomix на проточном цитометре.Определение линейного объема опухоли у животных с опухолью B16,определение активности ЦНС у животных путем оценки норкового и поисковогорефлексов.Математическая обработка данных была проведена с помощью программыStatistica 10 (StatSoft, США).
Для расчета статистической значимости отличий групп поколичественным показателям использовались непараметрические критерии парного имножественного сравнения.Степень достоверности и апробация работыВ работе использовано достаточное количество экспериментальных групп иобъем данных для каждой группы, результаты воспроизводимы, использованысовременные адекватные методы исследования. Сформулированные автором выводыдостоверны и логически следуют из результатов, полученных в ходе исследования.Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались наВсероссийскойнаучно-практическойконференции«Иммунопатологияииммунореабилитация: от теории к практике» (Пенза, 2015) и Международнойконференции “PhD Scientific Days 2017” (Венгрия, Будапешт, 2017).Апробация диссертации была проведена на заседании межлабораторнойнаучной конференции ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологиичеловека» (протокол №8 от 17 апреля 2016 года).7Личный вклад автора в получение результатовАвтор разработал дизайн диссертационной работы, освоил и эффективноприменил экспериментальные методы исследования для решения поставленных задач;выполнил статистическую обработку и описал полученные результаты; сформулировалвыводы и положения, выносимые на защиту.
В получении и публикации части данных,помимо научных руководителей О.В. Калюжина и М.В. Киселевского, вместе савтором участвовали В.В. Решетникова (НИИ экспериментальной диагностики итерапии опухолей ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центронкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России) и Н.К. Ахматова (ФГБНУ «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»). Синтезизучаемых соединений осуществлен профессором А.Е.
Земляковым (ТаврическаяакадемияФГАОУВО«КрымскийфедеральныйуниверситетимениВ.И.Вернадского»). При этом вклад автора в подготовку диссертации, автореферата инаучных публикаций по теме диссертационного исследования является определяющим.ПубликацииПо теме диссертации опубликованы 7 печатных работ, из них 2 статьи врецензируемыхнаучныхжурналах,рекомендованныхВысшейаттестационнойкомиссией при Минобрнауки России.Объем и структура работыДиссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит извведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 главрезультатовсобственныхисследований,рекомендаций, списка использованнойобсуждения,выводов,практическихлитературы.
Работа иллюстрирована 5таблицами и 49 рисунками. Указатель использованной литературы содержит 234библиографических источника, в том числе 40 отечественных и 194 иностранныхпубликаций.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯИсследуемые β-гептил-, β-децил-, β-додецил-, β-адамантил-, β-циклогексил-, βциклооктил- и β-циклодецилгликозиды МДП (табл. 1), а также МДП были любезнопредоставленыхимическогопрофессоромфакультетакафедрыКрымскогоорганическойфедеральногоибиологическойуниверситетаименихимииВ.И.Вернадского А.Е. Земляковым.
Все испытуемые соединения предварительно былиразведены в 0,9 % растворе NaCl.8Таблица 1Характеристика исследованных β-гликозидов МДПНазваниеСтроение агликонаМолекулярныйвес (Да)β-Гептилгликозид МДП590β-Децилгликозид МДП632β-Додецилгликозид МДП660Hβ-АдамантилгликозидМДП640МДПHHβ-Циклогексилгликозид574МДПβ-Циклоктилгликозид602МДПβ-ЦиклодецилгликозидМДП630МДПВ работе использованы клетки эритролейкемии человека линии К562,полученные из банка клеточных линий ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н. Блохина»,мононуклеарные лейкоциты (МНК) крови здоровых доноров, выделенные стандартнойметодикой, и дендритные клетки крови здоровых доноров, полученные по методу[Romani N., 1994].Эксперименты in vivo выполнены на половозрелых самцах мышей линииC57Bl/6 и CBA массой тела 18-22 г, полученных из Филиала "Столбовая" Федеральногогосударственного бюджетного учреждения науки "Научного центра биомедицинскихтехнологий Федерального медико-биологического агентства".9Влияние исследуемых соединений на цитотоксическую активность МНК кровиздоровых доноров по отношению к клеткам линии K562 исследовали при помощиколориметрического метода.
В экспериментальных группах клетки были инкубированыс исследуемыми соединениями и немодифицированным МДП в концентрациях 1, 5 и25 мкмоль/мл.Фагоцитарную активность нейтрофилов крови донора, коинкубированных сисследуемыми соединениями, определяли по методу [Гордиенко Г.И., 1984] снекоторыми изменениями. После коинкубации каждый образец ресуспендировали изабирали по 4 мкл крови из каждой виалы с последующим нанесением на предметноестекло с формированием мазка, окрашенного по методике Романовского-Гимза.Фагоцитарнаяактивностьбылаопределенаввидечислафагоцитирующихнейтрофильных гранулоцитов от общего числа обнаруженных клеток.
Фагоцитарноечисло было вычислено как среднее количество частиц, захваченных одной клеткой.При изучении влияния β-гептилгликозида МДП на созревание ДК человека этиклетки, полученные по стандартной методике [Romani N., 1994], инкубировали сисследуемым веществом или МДП в качестве референс-контроля в концентрации 10мкмоль/мл в течение 48 часов. После окончания инкубации в лунки добавляли антителак CD1а, CD40, CD80, HLA-DR, CD86, CD14 и CD83, меченные флуорохромами(флуоресцеин-изотиоцинат, фикоэритрин). Через 30 мин определяли количествоклеток, экспрессирующих данные маркеры, при помощи проточного цитофлуориметраBD Canto II («Becton Dickinson», США).Кроме того, после 48 часов культивирования ДК с β-гептилгликозидом МДПили МДП и последующей 30-минутной инкубации с мечеными антителами к CD14,CD80 и HLA-DR в концентрации 10 мкг/мл проводилась флуоресцентная микроскопияпри помощи системы Axiovision.Для определения влияния β-гептилгликозида МДП на концентрацию цитокиновв сыворотке крови мышам линии C57BL/6 внутрибрюшинно вводили 100 мклфизиологического раствора β-гептилгликозида МДП в концентрации 100 мкг/мл.
Вкачествереференс-контроляиконтроляиспользовалигруппыживотныхсвнутрибрюшинным введением соответственно 100 мкл физиологического раствораМДП в концентрации 100 мкг/мл или 100 мкл физиологического раствора. Забор кровиживотных производился через 1 час, 8 часов и 24 часа после введения препаратов.Сыворотку крови отделяли при помощи центрифугирования с последующимизмерением уровня цитокинов при помощи системы FlowCytomix на проточномцитометре.10Противоопухолевое действие β-гептилгликозида МДП оценивали по изменениюсредней продолжительности жизни (СПЖ) и торможению роста опухоли (ТРО) уживотных с привитой опухолью меланомы B16. Суспензию клеток меланомы В16(1×105 клеток в 0,1 мл питательной среды 199) трансплантировали самцам линииС57Bl/6 подкожно в область боковой поверхности грудной клетки.Исследуемое соединение вводили внутрибрюшинно в дозах 1 мкг; 5 мкг; 25 мкгна животное в 2 режимах (профилактический и терапевтический):- однократное введение за 24 часа до перевивки опухоли (профилактическийрежим);- введение через 24, 48 и 72 часов после перевивки опухоли, затем один разкаждые трое суток до гибели животных (терапевтический режим).ТРО определяли на основании измерения линейных размеров опухоли свычислением ее объема (V) и последующей оценки показателя ТРО по формуле: ТРО =(V в контроле – V в опыте) / V в контроле × 100%.Поведенческие реакции определяли в течение 90 секунд на каждое животное у 6животных, случайно выбранных из каждой группы на 10-е и 20-е сутки послеперевивки опухоли.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
