Часть 3 (1129751), страница 82
Текст из файла (страница 82)
В мышечных клетках содержится большой модифицированный гладкий ЭР,носящий название саркоплазматического ретикулума. Высвобождение и обратныйзахват Ca2+ саркоплазматическим ретикулумом запускают соответственно сокращение и расслабление миофибрилл в процессе сокращения мышцы (обсуждаемогов главе 16).Для изучения функций и биохимии ЭР необходимо его выделить.
Это кажетсябезнадежным делом, поскольку ЭР расположен пластами между другими компонентами цитоплазмы и переплетается с ними. К счастью, когда ткани или клеткиразрушаются гомогенизацией, ЭР распадается на фрагменты, которые заново замыкаются и образуют маленькие (~ 100–200 нм в диаметре) везикулы, называемыемикросомами. Микросомы относительно легко очищать. Для биохимика микросомыпредставляют собой маленькие достоверные копии ЭР, способные транслоцироватьи гликозилировать белки, захватывать и высвобождать Ca2+ и синтезировать липиды. Микросомы, образующиеся из шероховатого ЭР, покрыты рибосомами и носятназвание шероховатых микросом. Рибосомы всегда расположены на внешней поверхности, поэтому внутреннее пространство микросом эквивалентно люмену ЭР(рис. 12.37, а).В гомогенатах клеток также находят множество везикул, сходных по размерамс шероховатыми микросомами, но лишенных рибосомы.
Такие гладкие микросомы частично образуются из гладких участков ЭР и частично — из фрагментовплазматической мембраны, аппарата Гольджи, эндосом и митохондрий (соотношение зависит от типа ткани). Таким образом, если шероховатые микросомы точнопроисходят из шероховатых частей ЭР, происхождение «гладких микросом»,приготовленных из разрушенных клеток, определить не так просто. Исключениемслужат гладкие микросомы, полученные из клеток печени или мышц. Благодарянеобычно большому содержанию соответственно гладкого ЭР и саркоплазматического ретикулума, бóльшая часть гладких микросом в гомогенатах этих тканейобразуется из гладкого ЭР.
Рибосомы, прикрепленные к шероховатому ЭР, делаютего более плотным, чем гладкие микросомы. В результате мы можем использоватьравновесное центрифугирование для разделения шероховатых и гладких микросом(рис. 12.37, б). Микросомы сыграли неоценимую роль в объяснении молекулярныхГлава 12. Внутриклеточные компартменты и сортировка белка 1235Рис. 12.37. Выделение из ЭР очищенных шероховатыхи гладких микросом. (а) Электронная микрофотография тонкого среза очищенной фракции шероховатогоЭР показывает обилие покрытых рибосомами пузырьков. (б) При равновесном центрифугировании в градиенте сахарозы два типа микросом разделяют по ихразной плотности. (а, с любезного разрешения GeorgePalade.)аспектов функционирования ЭР, как мы покажем ниже.12.5.2. Сигнальные последовательности впервые обнаруженыу белков, импортируемых в шероховатый ЭРЭР захватывает определенные белки из цитозоля по мере их синтеза.
Это белкидвух типов: трансмембранные белки, которые только частично транслоцируютсячерез мембрану ЭР и остаются встроенными в нее, и водорастворимые белки,которые полностью переносятся через мембрану ЭР и высвобождаются в люмен.Некоторые из трансмембранных белков функционируют в ЭР, но большинствобудет транспортировано в плазматическую мембрану или мембраны других органелл. Водорастворимые белки предназначаются для секреции или люмена ЭРи других органелл. Все эти белки, зависимо от их последующей судьбы, направляет1236Часть IV. Внутренняя организация клеткив мембрану ЭР сигнальная последовательность ЭР, которая инициирует их транслокацию по обычному механизму.Сигнальные последовательности (и связанный с ними принцип сортировкибелков) открыты в начале 70-х гг. XX века в секретируемых белках, которыепереносятся через мембрану ЭР на первом этапе их вывода из клетки.
В ключевомэксперименте мРНК, кодирующая секретируемый белок, транслировалась рибосомами in vitro. Когда в такой бесклеточной системе отсутствовали микросомы,синтезированный белок был немного больше, чем нормальный секретируемый белок.Дополнительной частью служил N-концевой лидерный пептид. Однако в присутствии полученных из шероховатого ЭР микросом получался белок правильногоразмера. Согласно сигнальной гипотезе, лидерный пептид — это сигнальная последовательность, направляющая секретируемый белок в мембрану ЭР и отрезаемаясигнальной пептидазой в мембране ЭР перед завершением синтеза полипептидной цепи (рис. 12.38).
Бесклеточные системы, в которых белки импортировалисьв микросомы, позволили разработать эффективные методы идентификации, очисткии исследования различных компонентов молекулярного аппарата, ответственногоза процесс импорта в ЭР.Рис. 12.38. Сигнальная гипотеза. Исходно предложенный упрощенный взгляд на механизм транслокации белков через мембрану ЭР. Когда сигнальная последовательность ЭР выходит из рибосомы, онанаправляет рибосому к транслокатору на мембране ЭР, образующему пору, через которую переноситсяпептид. Сигнальная пептидаза тесно связана с транслокатором и отщепляет сигнальную последовательность в процессе транслокации, а зрелый белок высвобождается в люмен ЭР сразу после синтеза.Транслокатор закрыт до тех пор, пока с ним не свяжется рибосома, поэтому барьер непроницаемостимембраны ЭР поддерживается постоянно.Глава 12.
Внутриклеточные компартменты и сортировка белка 123712.5.3. Сигнал-узнающая частица (SRP) направляет сигнальные последовательности к определенному рецептору в мембране шероховатого ЭРСигнальная последовательность ЭР направляется в мембрану ЭР по крайнеймере двумя компонентами: сигнал-узнающей частицей (Signal Recognition Particle, SRP), которая циркулирует между мембраной ЭР и цитозолем и связываетсигнальную последовательность, и рецептором SPR в мембране ЭР. SRP представляет собой сложную частицу, состоящую из шести различных полипептидных цепей, связанных с единственной маленькой молекулой РНК (рис. 12.39).SRP и их рецептор присутствуют во всех клетках. Это указывает на то, что этотнаправленный на белки механизм эволюционировал очень рано и является консервативным.Сигнальные последовательности ЭР значительно различаются по аминокислотному составу, но все они несут в центре восемь и более неполярных аминокислот (см.таблицу 12.3, стр.
1237). Благодаря чему SRP способны специфически связывать такмного различных последовательностей? Ответ на этот вопрос дала кристаллическаяструктура белка SRP. Она показала, что сайт связывания сигнальной последовательности представляет собой крупный гидрофобный карман, выстланный метионинами.Поскольку боковые цепи метионинов не ветвятся и обладают гибкостью, кармандостаточно пластичен для захвата гидрофобных сигнальных последовательностейразличного аминокислотного состава, размера и формы.SRP представляет собой стержневую структуру, оборачивающуюся вокругбольшой рибосомной субчастицы.
Один ее конец связывается с сигнальной последовательностью по мере ее выхода из рибосомы в составе синтезируемой полипептидной цепи; второй конец блокирует сайт связывания фактора элонгации в местесоединения большой и малой рибосомных субъединиц (рис. 12.39). Благодаряэтой блокировке синтез белка останавливается сразу после того, как сигнальнаяпоследовательность выходит из рибосомы. Эта пауза, по-видимому, дает рибосомедостаточно времени для связывания с мембраной ЭР до завершения полипептидной цепи и, следовательно, не позволяет белку оказаться в цитозоле. Такоезащитное приспособление особенно важно для секретируемых и лизосомальныхгидролаз, которые могут нанести значительный ущерб цитозолю; однако клетки,секретирующие большое количество гидролаз, принимают дополнительные мерыбезопасности – в их цитозоле содержится высокая концентрация ингибиторов этихферментов. Также, благодаря паузе, пока рибосома не достигнет транслокаторав мембране ЭР, не синтезируются способные свернуться в компактную структурубольшие участки белков.
Таким образом, в отличие от посттрансляционного импорта белков в митохондрии и хлоропласты, для противодействия сворачиваниюбелков не нужны шапероны.После образования комплекс SRP-рибосома связывается с рецептором SRP,который представляет собой интегральный мембранный белковый комплекс, встроенный в мембрану шероховатого ЭР. За счет этого взаимодействия происходитсближение комплекса SRP-рибосома и транслокатора белков. Затем SRP и рецепторSRP высвобождаются, и транслокатор переносит растущую полипептидную цепьчерез мембрану (рис. 12.40).Процесс котрансляционного переноса создает две пространственно разделенныепопуляции рибосом в цитозоле. Мембраносвязанные рибосомы, прикрепленные к ци-1238Часть IV.
Внутренняя организация клеткиРис. 12.39. Сигнал-узнающая частица (SRP). (а) SRP млекопитающих представляет собой продолговатыйкомплекс, состоящий из шести белковых субъединиц и одной молекулы РНК (показана красным). РНКSRP образует стержень, соединяющий домен SRP, несущий карман связывания сигнальной последовательности, с доменом, ответственным за остановку трансляции. Трехмерная поверхность SRP (показанасерым) определена при помощи криоэлектронной микроскопии. Известные кристаллические структурыотдельных частей SRP встроены в оболочку и показаны в виде ленточных диаграмм.
Связанная сигнальнаяпоследовательность показана в виде зеленой спирали. (б) Связанный с рибосомой SRP, визуализированный посредством криоэлектронной микроскопии. SRP связывается с большой рибосомной субчастицейтак, что ее карман связывания сигнальной последовательности расположен вблизи сайта выхода синтезируемой цепи, а домен остановки трансляции — в месте соединения рибосомных субчастиц, гдеон мешает связыванию фактора элонгации. (Адаптировано из M. Halic et al., Nature 427: 808–814, 2004.С любезного разрешения издательства Macmillan Publishers Ltd.)топлазматической поверхности ЭР, участвуют в синтезе белков, которые будут впоследствии транслоцированы в ЭР. Свободные рибосомы, не прикрепленные к какойлибо мембране, синтезируют все остальные белки, кодируемые ядерным геномом.Рис. 12.40.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
