Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 30
Текст из файла (страница 30)
6.1!. Значение величин Км н $',„ Км для разных ферментов варьирует в широком диапазоне величин (табл. 6.1). Для большинства ферментов величина Км лежитвпределах 10 ' — 10 6 М.ЗначениеКм фермента зависит от природы субстрата, а также от условий среды: температуры, ионной силы. Константа Михаэлиса Км имеет два смысловых значения. Во-первых, Км — зто концентрация субстрата, при которой занята половина активных центров фермента. Если известна Км, то можно рассчитать, какова доля занятых активных центровуид для любой концентрации субстрата: У Я УББ = — = %+ Км (17) )62 Км= )Сз (18) Константа диссоциация комплекса ЕЯ описывается уравнением М С81 (Е8] /<, (19) Во-вторых, Км связана с константами скоростей отдельных этапов катализа, представленных в уравнении (1). Согласно уравнению (7), Км равна ()62+)сз)/(67.
Рассмотрим крайний случай, когда )гз намного выше )гз, т.е. диссоциация комплекса Е8 на Е и Я происходит гораздо быстрее, чем образование Е плюс продукта реакции. В этих условиях ()62» /сз) ферментюубстратного взаимодействия. Следует еше раз подчеркнуть, что по значению Км можно судить о сродстве фермента к субстрату только при условии, что )62 значительно больше )сз. В действительности так оно и бывает во многих, хотя и не во всех случаях.
Максимальная скорость )г, отражает число оборотов фермента, если известна концентрация активных центров (Е„), так как (20) Р „= )гз ~ЕТ3 Таблица 6.1. Величины Км некоторых фермеитоа Субстрат Фермент Км, М 5 П1- з Химотрипсии Ацегил-1 7рилтофа- намид Гекса-Х-ацетилглю- козамии Лактоза Треонии С~~7 БЕНЗИЛПЕНИЦИзгани Пируаат псоу АТР Аргииин 6-10 Лизоцим 4 Ю-3 5 10-з 3, Из-з 5 10 4Юз 1 Ю-' 6.10' з з ю-' 0-Галактозидаза Треоииидезамииаза Карбоаигццраза Пеиициллиназа Пируааткарбоксилаза Аргинии-тРНК вЂ” сии- тетаза Например, прн полном насыщении субстратом растворенная карбоангидраза в концентрации 10 ' М катализирует образование 0,6 М Н,СО, в секунду.
Отсюда )гз = = 6 10 з с '. Кинетическая константа (гз называется числом оборотов. Число оборотов фермента-это то количество молекул субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени цри полном насыщении фермента субстратом. Число оборотов 6 10' с ', характерное для карбоангидразы,— самое большое из всех известных, Каждый новый каталитический акт происходит через промежуток времени, равный 17768, что для карбоаигидразы составляет 1,7 мкс. Число оборотов большинства ферментов при использовании физиологических субстратов находится в пределах 104 в секунду (табл.
6.2). 4 Ю-7 тРНК АТР Другими словами, если lтз намного меньше, чем )62, та Кы равна константе диссацшщии Е5-комплекса. При указанном условии Км служит мерой прочности Еб-комплекса: высокая Км — показатель слабого связывания субстрата; низкая Км - показатель сильного 113 б. Введение в энзнмологию 8-665 6.12.
О степени совершенства кинетики фермевтативного катализа судят по крвте)схвт/Км Когда концентрация субстрата намного превышает Км, скорость катализа численно равна й,, т.е. числу оборотов, как это описано в предыдущем разделе. Однако в физиологических условиях концентрации субстратов в большинстве случаев ниже насыщающих.
Отношение [Я/Км обычно колеблется от О,1 до 1,О. Если [Я сс Км, то скорость ферментативной реакции значительно ниже й и поскольку большинство активных центров остается свободным. Существуют ли такие параметры, с помощью которых можно описать кинетику ферментативных реакций в этих условиях? Такие параметры имеются и их можно получить, объединив уравнения (2) и (8): (21) Если [Я « Км, то концентрации свободно- го фермента (Е) практически равна общей концентРации феРмента [Ет3, и тогда ' [о! [Ет). Км (22) "з )сз)сс (23) Км "з + )сз Таким образом, при [03 «Кы скорость фврментативной реакции зависши от величины й,/Ки и от [а).
В каких границах лежит отношение )сзгсКм? Обратите внимание, что оно зависит от й„)ст и /сз, как можно это показать путем замещения Км: и применительно к ферментам, имеющим более сложный механизм реакции, чем тот, что описан в уравнении (1). В случае таких ферментов максимальная скорость катализа при насыщающих концентрациях субстрата, обозначаемая й„„, зависит не от одной йз, а от нескольких констант скоростей. Параметром, характеризующим эти ферменты, является )с„„ггКм. Для ряда ферментов, в частности для ацетилхолинэстеразы, карбоангидраэы и триозофосфатизомеразы, отношение )смысКм колеблется от !0в до 10о М ' с ', что свидетельствует о достижении ими пракпшчески совершенной кинетики:скорость котализируемых ими реакций ограничивается только частотой столкновения фермента с субстратом. Дальнейшее повышение скорости реакции возможно только на основе уменьшения времени диффузии.
В действительности часто бывает так, что ферменты, обеспечивающие отдельные метаболические последовательности, организованы в сложные комплексы (разд. 13.10), благодаря чему продукт реакции, каталнзируемой одним ферментом, быстро попадает иа следующий фермент. Таким образом, ограничения, накладываемые скоростью диффузии в растворе, частично снимаются тем обстоятельством, что субстраты и продукты оказываются в малом объеме на полнферментном комплексе. 6ЛЗ. Фермеяты могут ингибироваться специ- фическими молекулами Ингибироваиие ферментативной активно- сти небольшими специфическими молекула- ми и ионами имеет очень важное значение, поскольку в биологических системах служит Предел, которого может достичь отношение )сзгсКм, определяется значением й„т.е. скоростью образования комплекса ЕВ. Эта скорость не может превышать число столкновений фермента с субстратом, контролируемое скоростью диффузии.
Из-за этого накладываемого диффузией ограничения значение й, не может быть выше 10в — 10е М 'с '. Отсюда следует, что верхний предел отношения lсз/Км составляет 10в-!Ое М 'с Это ограничение сохраняет свою силу Часть 1 114 Конформации и динамика Таблица б.2. Мвнеинвлвиое число оборотов иеноторых ферментов Число оборотов (в рвсчете ие 1 с! Фермент Кврбовигицрвхв 3-Охсостероиц итомервхв Ацетилхолиитстервтв Пенициллиново Лехтвтцегилрогеивте Химотрицсии ДНК-цолимервзв ! Трицтофвисиитвзе Лиховом 600 000 гвоооо 25 000 2 000 1 000 100 15 г 0,5 н ( Н С вЂ” С вЂ” СН з з Н Н С вЂ” С вЂ” СН з 3 О ( — ь вермонт — СН7 — Π— Р=О + НЕ ) ΠΠŠ— Р=О ( О Н С вЂ” С вЂ” СН 3 з Н Н С вЂ” С вЂ” СН 3 ) 3 Н Дннвоззронннфторфоо Ииактивация химотрипсина и ацетилхолинэстеразы диизопропилфторфосфатом. Рис.
6.14. СОО ) СН7 СОО СОО СН СН СОО о О О (~ Овомвнт — СН.3Н+ !СН7 — С вЂ” НН7 — ~ ОвРмвнт — СН. ь СН7 — С вЂ” НН, + Н! Иодвцвтвммд Рис. 6.15. Инактивация иодоацетатом фермента, для активации которого остаток цистеина имеет критическое значение. 115 6. Введение в энзимолопио основным механизмом контроля. Подавление ферментативной активности лежит также в основе действия многих лекарственных веществ и токсических агентов. Наконец, анализ ингибироваиия ферментов является одним из подходов к изучению механизмов ферментативного действия.
Ингибирование ферментов может быть как обратимым, так и необратимым. При необратимом ингибировании ингибитор ковалентио соединяется с ферментом или же связывается так прочно, что диссоциация идет очень медленно. Пример необратимого ингибирования— действие иервнопаралитических ядов на ацетилхолинэстеразу, играющую важную роль в передаче нервных импульсов. Одно из ~аких отравляющих веществ — диизопропилфторфосфат-взаимодействует с имеющим критическое значение остатком серина в активном центре фермента с образованием неактивного комплекса диизопропилфосфорил — фермент (рис. 6.14).
Алкилирующие агенты, например иодоацетамид, способны к необратимому ингибированию ферментов путем модификации цистеина и других боковых цепей (рис. 6.15). В отличие от рассмотренной ситуации при обратимом ингибировании равновесие между ингибитором и ферментом устанав- ливается быстро. Простейший вид обратимого ингибирования-это конкурентное ингибирование.
Конкурентный ингибитор похож на субстрат и потому связывается активным центром фермента (рис, 63 6). Это препятствуе~ связыванию субстрата в том же активном центре. Иными словами, невозможно одновременное связывание субстрата и конкурентного иигибитора. Конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа лутивм снижения доли молекул фермента, связавших субстрат. Классический пример конкурентно~о ингибирования — действие малоната на сукцинат-депщрогеназу — фермент, отщепляющий от сукцината ионы водорода. Малонат отличается от сукцината тем, что имеет не две метильные группы, а одну: Сукцннвт Ммнтвт Физиологически важный пример конкурентного ингибирования связан с образованием 2,3-бисфосфоглицерата из 1,3-бисфосфоглицерата. Фермент, катализирующий эту изомеризацию,— бисфосфоглицератмутаза-конкурентно ингибируется низкими концентрациями 2,3-бисфосфоглицерата.
Конкурентный ингиоитор Суострет Стестрет Неконкурентный иигиоитор Рис. 6.16. Е+ 1 Е1, (Е) (Ц '(ЕЦ 0 С вЂ” ОРО ' Н вЂ” С вЂ” ОН НтС вЂ” ОРО т Кэвиефеефегницерет 0 !! С вЂ” 0 ! Н вЂ” С вЂ” ОРО жа.аиефеефегиицерет (25) Различие между конкурентным и неконкурентнылт ннгибитором: слева — фермент-субстратный комплекс; в с еред и н е — конкурентный ингибитор препятствует связыванию субстрата; справа -неконкурентный ингибитор не препятствует связыванию субстрата. В сущности, это довольно обычное явление, когла продукт ферментативной реакции ведетсебя как конкурентный ингнбитор в силу структурного сходства с субстратом. При неконкурентном, но нюжв обрагпимом ингибировании ингибитор и субстрат могут связываться молекулой фермента одновременно; само по себе это показывает, что участки их связывания не перекрыватотся.
Действие неконкурентного ингнбитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Возможны и более сложные механизмы ингибирования, когда ингибитор влияет и на связывание субстрата, и на число оборотов фермента. Активность фермента может быть ингибнрована также в результате взаимодействия между разными субъединицами олигомерного фермента.
Этот тип ннгибирования, называемый аллостврическим ингибированием, имеет очень важное значение для физиологических процессов. Мы его рассмотрим несколько ниже. Часть 1 Пб Конформвция и динамика 6.14. Конкурентное и неконкурентное ингнбироваиие различаются по кянетике Измерение скоростей катализа при разных концентрациях субстрата дает возможность отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике, где 1/Уотложена против !/(Б), прямая пересекает ось ординат в одной и той же точке независимо от присутствия ингибитора„меняется только угол наклона прямой (рис.
6.17). Это показывает, что при конкурентном ингибированин У „ не изменяется. Особенность конкурентного ингибировиния состоит в том, что при достаточно высокой концентрации субстрати ингибирование может быть преодолено. В самом деле, субстрат и ингибитор конкурируют за один н тот же участок. При достаточно высокой концентрации субстрата почти все активные лент.ры заняты субстратом и фермент проявляет полную активность. Увеличение угла наклона прямой на графике зависимости 1/1'от 1/Я указывает на прочность связи конкурентного ингибнтора.
В присутствии конкурентного ингибитора уравнение (16) заменяется следующим: где (Ц-концентрация ингибитора, а К,— константа диссоциации комплекса фер- мент-ингибитор Другими словами, в присутствии конкурентного иигибитора наклон прямой увеличи- (Ц '1 вается на величину 1+ /1. Рассмотрим к,.( фермент с Км, равной 10 4 М. В отсутствие ингибитора 1' = 1' „/2 при ($] = 10 4 М. В присутствии 2 10 ' М конкурентного нн- + Конкурентный ннгнбнтор Е = ЕЯ вЂ” + Е ьв Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
