Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 24
Текст из файла (страница 24)
В то же время у носителей признака серповидноклеточности (которые гетерозиготны по гену серповндноклеточностн) оба гемоглобина содержатся примерно в равных количествах (рис. 5.5). Таким образом, в работе Полннга был выявлен бесспорный случай изменения молекулы белка при изменении аллелей коднрующего его гена. Это был первый пример молекулярной болезни. 5, Молекулярные болезни: серповидноклегочная анемия нь л НЫ Положительно за- Нейтральная аминокислОта раненная амино- кислота Положительно заряженная амино- кислота Отрицательно заря- женная амино- кислота Рнс. 5.5. Нейтральная амино- кислота Отрицательно заря- женная амино- кислота Эпвктрофо рвз в горизонтальном Хроматография в вертикальном Рнс.
5.6. 5.4. Получение пептидных карт: выявление аминокнслотиой замены в гемоглобнне серповидных клеток Итак,электрофоретический анализ показал, что гемоглобин Б имеет 2-4 дополнительных положительных заряда по сравнению с гемоглобином А. Возможны разные пути возникновения такого различия в заряде молекулы: Выяснение вопроса, какая конкретно замена произошла в гемоглобине Я, относится к 1954 г,, когда Вернон Ингрем (зт. 1пйгетп) разработал новый метод определения аминокнслотных замен в белках. Для проведения анализа молекулу гемоглобина расщепляли на фрагменты, поскольку в небольших пептидах, содержащих примерно по 20 аминокислот„выявить замену аминокислоты, безусловно, легче, чем в целой молекуле белка, значительно большей (в 10 раз) по размеру. Гемоглобин подвергали специфическому расщеплению трипсином по пептидным связям, образованным карбоксильными группами лизина и аргинина.
Смесь пептидов разделяют путем электрофореза в горизонтальном направлении с последующей хроматографией в вертикальном направлении. Часть 1 Конформации и динамика Признак СарповидноНорма серповидно- клеточная кпвточности анемия Электрофорез на крахмальном геле при рН 8,6 гемоглобина здорового человека, гемоглобина носителя признака серповидноклеточностн и гемоглобина больного серповидноклеточной анемией. Поскольку в и()-половине гемоглобина содержится в общей сложности 27 остатков лизина и аргина, при триптическом гидрализе образовалось 28 разных пептидов. Следующий этап состоял в разделении полученных пептидов.
Для этого был применен метод двумерного разделения (рис. 5.б). Смесь пептидов наносили в виде небольшого пятна в угол большого листа фильтровальной бумаги. Далее проводили электрофорез в одном направлении, разделяя таким образом пептцды в соответствии с их общим зарядом. Однако полного разделения смеси при этом не происходило. Многие пептиды накладывались друг на друга. Поэтому продолжалн процесс разделения, но уже методом хроматографии на бумаге, причем это разделение проводили в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза.
Хроматография— термин введен Михаилом Цветом в! 906 г. применительно к разделению смеси пигментов из листьев растения на колонке карбоната кальция. М. Цвет сравнил этот процесс с «разложением света на спектр». Образовано от греческих слов сЬгоша-цвет и йгар)»еш — рисовать, писать. Процедура состояла в следующем: конец бумаги, ближайший к разделяемым пептидам, помещали в смесь органических растворителей и воды, налитую на дно герметично закрывающейся стеклянной банки.
При этом растворитель поднимался вверх по бумаге. В такой ситуации каждый пептид мог либо мигрировать с растворителем (не- полярная среда), либо оставаться на обводненной целлюлозе бумаги (высокополярная среда). Такой метод разделения называется распределительной хроматографией. Пептид с наиболее выраженными неполярными свойствами будет растворяться в растворителе и, следовательно, подниматься вместе с фронтом растворителя вверх по бумаге; в то же время самый полярный нз пептидов останется на бумаге внизу. Рассматриваемые методы — хроматография на бумаге и электрофорез — дополняют друг друга, поскольку они разделяют пепт|щы на основе независимых свойств; первый — на основе различий в полярности, второй -на основе различий в общем заряде.
Вся последовательность проведения анализа — избирательное расщепление белка на небольшие пептиды сих последующим разделением в двух направлениях †называет методом пептидных карт (отпечатков пальцев). Получаемые в результате пептидные карты дают очень наглядный результат. После окрашивания нингидрином пятна пептидов становятся ясно видны. Сравнение карт гемоглобина А и гемоглобина Б показало, что все их пептидные пятна идентичны, эа исключением одного. Это пятно элюировали с каждой из пептидной карт и определили, что в обоих случаях оно соответствует пептцду из 8 аминокислот.
При последующем аминокислотном анализе обнаружилось, что пептнд гемоглобина $ отличается от пептида гемоглобина А лишь по одной аминокислоте. 5.5. В б-пенн произошла замена одной-единственной аминокислоты и- и б-Цепи разделили методом ионообменной хроматографии. Далее получили их пептидные карты. Оказалось, что гемоглобин 8 отличается от гемоглобина А по (3-цепи, в частности по )»(-концевому триптическому Ф Ю на» ~ Ф Ф~р, ® Ф в*а~»ц Старт Гемоглобин А Старт Гемоглобин 8 Сравнение окрашенных нингидрином пептидных карт гемоглобина А и гемоглобина Я.
Красным кружком обведен пептид, по которому различаются эти гемоглобины. (Печатается с любезного разрешения д-ра С. Ваййош.) 5. Молекулярные болезни: серповндноклеточная анемия 93 пептиду )1-цепи. Определив аминокислоз.- ную последовательность этого пептида, Ингрем показал, что в ()-цени гемог,юбина 5 в б-м нолоясенин вместо глутамата стоит валин: гьмыллбин л У«1-1!1ь-1 еогтЬг-Рго-О)о-('Ьз-!.узГлмагллбин в Уа1-Н!л-!.си-ТЬг-рго-х а1-Яо-(.ул- )1! 2 3 4 5 6 7 8 5.6.
На поверхности гемоглобина серно- видных клеток имеютси «липкие» участки Валин имеет неполярную боковую цепь, тогда как глутамат — высокополярную. Замена глутамата валином в 6-м положении ()- цепи приводит к тому, что на поверхности гемоглобина Б оказывается неполярный остаток (рис. 5.8). В результате растворимость деэокснгенированного гемоглобина 5 значительно соиэкавтся, тпгда как растворимпсть оксигенированногп гемоглобина 5 яра«та«вски не мэменявтся, Этот факт лежит в основе всей клинической картины серповидноклеточной анемии, а также особенностей, характерных для признака серповидноклеточности. Молекулярный механизм появления серповидных эритроцитов можно представить себе следующим образом. !.
Замена глутаминовой кислоты на валин приводит к появлению «липкого» участка (вбегу рагсЬ) на наружной стороне кв:кдой ))-цепи гемоглобина Я (рис. 5,9). Такой «липкий» участок имеется как в окси-, так и в дезоксигемоглобнне Б, но не в гемоглобине А. 2. В дезоксигемоглобине Б имеется участок, комплементарный «липкому» участку (рис. 5.9). Локализация комплементарного участка пока не установлена. Комплементарный участок одной молекулы дезоксигемоглобина 5 взаимодействует с «липким» участком другой молекулы дезоксигемоглобина 8, что приводит к образованию агрегатов большой длины, деформирующих эритроцит.
3. В оксигемоглобине 5 комплементарный участок замаскирован. «Липкий» участок в нем имеется. Однако недоступность комплементарного участка препятствует соединению молекул гемоглобина Я друг с другом. 4. Таким образом, эритроциты сероовид«пй формы появляются в условиях, когда дв- Часть ! Конформации и динамика 94 зоксигенированная форма гемоглобина 5 достигает высокой концентрации (рис.
5.!0). Исходя из этих фактов, можно объяснить ряд клинических симптомов серповидноклеточной анемии. Так, при появлении серповидных эритроцитов в мельчайших сосудах возникает порочный круг. Серповидные клетки блокируют кровеносный сосуд, что Ф создаст локальную недостаточность кислорода. В результате в этом участке больше гемоглобина переходит в дезоксиформу и еще больше образуется деформированных, серповидных эритроцитов. У носителей признака серповидноклеточности симптомов болезни обычно не наблюдается, потому что содержание гемоглобина 8 в этом случае не превышает половины общего количества гемоглобина.
При нормальной концентрации кислорода такое содержание гемоглобина Я не настолько велико, чтобы вызвать деформацию эритроцита. Однако прн значительном снижении царциального давлении кислорода (на большой высоте, например) серповидные эритроциты могут появиться и у носителей признака серповидноклеточности. Модель дезоксигемоглобина А при низком разрешении, а-Цепи показаны желтым, ()- цепи- голубым, Участок, в котором произошла замена аминокислоты в гемоглобине Я, отмечен красным. Обратите внимание, что этот участок находится на поверхности молекулы, [г)псЬ 1.Т., Регпгх М.Г., Вег11ея 1.
Г., (эбЫег )н Ргос. )ь)аг. Асад. Вс), 70, 721 (1973).1 Деза«си 8 О«си А Деза«си А О«ои 8 Рис. 5.9. 1<<т = )<(с7С,)", Ряс. 5.10. Красными треугольниками показаны «липкне» учас<ки, имеющиеся как в окон-, так и дезоксигемоглобине Б, но отсутствующие в гемоглобнне А. Комплементарный участок изображен в виде зазубрины, соответствующей треугольнику. Этот комцлементарный участок имеется в дезоксигемоглобнне Б и не исключено, что и в дезокснгемоглобине А.
5.7. Дезокснгемоглобин 5 образует длинные сиирвлнзованные волокна Как указывалось выше, дезоксигемоглобин 5 образует волокнистый осадок, который деформирует эритроциты, придавая нм серповидную форму (рис. 5.2). При электронно-микроскопическом исследовании выявляются волокна двух типов: диаметром 170 А (рис. 5.3) н чаще диаметром 215 А (рис.
5.11). По-видимому, в основном образуются волокна, представляющие собой спираль из 14 нитей, в которой 10 молекул гемоглобина 5 расположены снаружи и 4 молекулы — внутри (рнс. 5.12). Существенная особенность этой построенной из нитей спирали состоит в том, что каждая молекула гемоглобина Б контактирует по крайней мере с восемью другими. Ясно, что спираль стабилизирована многочисленными связямн. Связь с участием валина-б в )3-цепи сдвн- Взаимодействие <шипкого» участка в дезоксигемоглобнне 5 с комплементарным участком другой молекулы дезоксигемоглобина 8 приводит к образованию длинных агрегатов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
