Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Гем гемоглобина (желтым показано Ге, синим. Х, красным — О, черным .С). ства белков снижается при добавлении любых солей в высокой концентрации. Этот эффект называется выеиливанием. Полученные таким образом кристаллы миоглобина (рис. 3.5) могут достигать нескольких миллнмезров в длину. Для проведения рентгеноструктурного анализа необходимы три компонента: источник рентгеновских лучей, кристалл белка н детектор (рнс. 3.6). Рентгеновское излучение с длиной волны 1,54 А получают путем бомбардировки медной мишени ускоренными электронами. Узкий пучок рентгеновских лучей направляется на кристалл белка.
При этом часть пучка проходит через кристалл, не меняя своего направления, тогда как другая часть расееиваетсл в различных направлениях (дифракиил лучей). Рас- Рне. 3.4. Кристаллизация миоглобина. сеянные пучки лучей попадают на фото пленку, причем степень потемнения эмульсии на пленке пропорциональна интенсивности падающих на нее лучей. В основе метода лежат следуюШие физические принципы: 1. Рентгеновские лучи рассеиваются электронами. Амплитуда волны, рассеиваемой атомом, пропорциональна числу электронов в атоме. Так, атом углерода рассеивает лучи в шесть раз сильнее, чем атом водорода. 2. Рассеянные волны взаимолействуют друг с другом (ннтерферируют).
Каждый атом вносит свой вклап в отклонение каждого пучка лучей. Рассеянные волны могут усиливать или гасить друг друга в зависимости от того, совпадают они по фазе или нет. 3. Характер взаимодействия рассеянных волн целиком определяется расположением атомов в исследуемом вешестве. 3.3. Этапы рензтеноструктурного анализа многлобина Кендрью выбрал миоглобин для проведения рентгсноструктурного анализа в силу многих причин: это относительно небольшой белок [17,8 кДа), его легко получить в больших количествах, и он легко кристаллизуется. Кроме того, миоглобин имеет и то достоинство, что он очень сходен с гемоглобином, исследованием которого уже занимался коллега Кендрью Перузц.
В работе был использован миоглобин из скелетных мышц кашалота, отличающийся стабильностью и способностью великолепно кристаллизоваться. Скелетные мышцы ныряющих млекопитающих — китов, тюленей, дельфинов — особенно богаты миог;юбином, который служит для резервирования кислорода, используемого во время ныряния. Кристалл миоглобина помешают в капилляр и строго ориентируют по отноше- 3. Переносчики кнслорода- миоглобнн и гемоглобин Рассепннме пуча Рис. 3.6.
Рис. 3.5. Кавапот нию к пучку рентгеновских лучей и к пленке. В результате прецессионного движения кристалла на рентгеновском фотоснимке образуется регулярная решетка пятен (рефлексов). Рентгеновская фотография, показанная на рис. 3.7, представляет собой двумерное сечение через трехмерное множество рефлексов. Кристалл миоглобина дает 25000 рефлексов. Измеряют интенсивность каждого рефлекса. Получаемые величины представляют собой те исходные экспериментальные данные рентгеноструктурного анализа, которыми оперируют далее. На следующем этапе воспроизводят структуру миоглобина, исходя из полученных значений интенсивности рефлексов: это производится с помощью математического метода представления сложных функций в виде гармонических рядов Фурье.
Однако величины интенсивности рефлексов от кристаллов миоглобина дают только часть информации, необходимой для таких расчетов. Недостающие данные о фазах рассеянных пучков лучей получают из полной картины дифракции лучей кристаллом миоглобина, содержащего;юкелые атомы, например уран или свинец, по одну или две стороны молекулы. После этого переходят к расчету карты электронных плотностей, используя быстродействующие ЭВМ. По счастью, развитие кристаллографических исследований миоглобина совпало по времени с появлением быстродействующих ЭВМ с большим объемом памяти.
Окончательный расчет по методу рядов Фурье Фотография кристаллов мио- глобина. (Печатается с любез- ного разрешения д-ра й Ке- пс)геур.) Часть 1 Конформация и динамика а источник Ренттеноаскни пуч — — ~о-. скмк пучеа Кристера Детектор(например пленка) Схема установки для проведения рентгеноструктурного анализа: рентгеновский луч, кристалл, детектор. для миоглобнна включал в себя около миллиарда величин. В результате проведенной математической обработки получают величины электронной плотности в большом числе регулярно расположенных в пространстве точек кристалла. При этом трехмерное распределение электронных плотностей имеет вид серии наслоенных один нап другим параллельных срезов. Каждый срез представляет собой прозрачную пластинку из синтетического материала, на которой распрелеление электронных плотностей показано контурными линиями (рис.
3.8). Такое изображение можно сравнить с картой рельефа земной поверхности, на которой контурными линиями обозначается высота местности над уровнем моря (рис. 3.9). Следующий этап работы состоит в расшифровке карты электронных плотностей. Критическим фактором при этом выступает разрешаютауссч способность метода рентгеноструктурного анализа, которая определяется количеством рефлексов, использованных в обратном преобразовании Фурье.
Правильность изображения зависит от разрешающей способности обратного преобразования Фурье, как это показано с помощью оптической аналогии на рис. 3.10. Анализ миоглобина был выполнен в три этапа. На первом этапе, завершенном в 1957 ги анали- Рис. 3.8. 53 Рис. 3.7. Рентгенограмма кристалла многлобина. Часть карты электронной плотности миоглобина: участок тема. Пик в центре соответствует положению атома железа. (Келлоге» 1.С., Тпе гпгег)ипепз(опа) з1гпсгпге о( а ргогеш шо1есп1е, Бс(епг(()с Ашег(сап, 1пс., 1961.) зу были подвергнуты только 400 внутренних рефлексов на дифракционной картине, что соответствовало разрешению 6 А. Как будет показано несколько ниже, такая карта электронных плотностей низкого разрешения описывает полипептидную цепь, но выявляет мало других деталей структуры.
Дело в том, что из-за особенностей укладки полипептндных цепей их центры расходятся на 5-10 А. Чтобы выявить расположение групп атомов, отстоящих на 2,8-4,0 А друг от друга, или отдельных атомов, разделенных расстоянием в 1,0 — 1,5 А, требуются карты более высокого разрешения. В 1959 г. была получена карта миоглобина с разрешением 2 А (10000 рефлексов), а в 1962 г.-с разрешением 1,4 А (25000 рефлексов). Предел разрешающей способности рентгеноструктурного анализа определяется степенью совершенства структуры кристалла. Для белков этот предел обычно не ниже 2 А. В 1957 г.
Кендрью и его сотрудники увидели то, чего до них никто не видел: пространственную структуру белковой молекулы во всей ее сложности. Модель, построенная на основании обратного преобразования Фурье с разрешением 6 А, состояла нз набора отрезков высокой плотности, имеющих именно те размеры, какие и приписывались полипептидной пепи (рис. 3.11). Молекула имела очень компактный внд. Более подробное изучение показало, что она состоит из сложной н переплетающейся сети этих отрезков, которые Рис.
3.9. Часть физической карты США; показан участок Капитол-пика, штат Колорадо 3. Переносчики кислорода— ииоытабин н гемоглабин Рис. 3.10. Рнс. 3.11. Фдв в 4Фь Ф~11® "мин~ Влияние разрешающей способности на качество реконструированного изображения. Для иллюстрации использован оптический аналог дифракции рентгеновских лучей. А — Парфенон, Б — картина дифракции от Парфенона, В и à — изображения, полученные по данным, взятым из рис. Б. Для получения изображения, показанного на рис. Г, использовано больше точек, чем для получения изображения на рнс. В. Соответственно изображение Г значительно выше качеством. (Печатается с любезного разрешения д-ра Т. Бге(гх (А) и д-ра )3. Ре Кох)ег (Б).) Часть 1 Конформации н динамика то шли прямо на некотором протяжении, то делали угол, меняя направление. Расположение атома железа в гаме было легко установить, так как железо содержит значительно болыпе электронов, чем любой другой атом в белке.
Самое поразительное в структуре молекулы-это ее неправильность и полное отсутствие симметрии. 3.4. Структура чиоглобииа характеризуется компактностью и высокой степенью о-спирализованности Полученная двумя годами позже карта электронных плотностей миоглобнна с высоким разрешением содержала колоссаль- Модель миоглобнна, полученная при низком разрешении. (Любезно предоставлена д-ром 1. Кепдгеи.) Рис.
ЗЛ2. Модель миоглобина, полученная при высоком разрешении. Показаны только а-угле- родные атомы. Красным дан тем. (Вйс)гегзоп й.Е. 1п: Т)зе Ргоге)пя, Н. )ь)епга1)э, ег)., 21)з ед., ч, 2, Асас)еш)с Ргевз, 1964, р. 634.) ное количество информации относительно деталей структуры белка. Из 1260 атомов, т.с. всех атомов, кроме водорода, положение 120 атомов было определено с точностью, превышающей 0,3 А. Общее расположение основной цепи и гема показано на рис. 3.12. Структура миоглобина имеет следующие особенности: 1.
Молекула мной лабина чрезвычайно компактна. Ее объем равен 45 х 35 х 25 А. Внутри молекулы почти нет свободного пространства, 2. Около 75";„ основной цепи находится в конформации и-спирали. Все а-спирали правозакрученныс. Имеется 8 основных участков спирализации, которые обозначены первыми 8 буквами латинского алфавита: А, В, С, ..., Н. Первый аминокислотный остаток в спирали А обозначают А1, второй А2 и т.д. (рис. 3.13). Между областями спнрализации находится пять неспирализованных участков (обозначаемых, например, СО, если участок расположен между спиралями С и О). Имеются еще два неспирализованных участка: два аминокис- лотных остатка на )ь)-конде молекулы (называемые )ь)А1 и )ч)А2) и пять остатков — на С-конце (обозначаются соответственно от НС1 до НС5).
3. Не все факторы, определяющие терминнрование участка спирализадии, уже выявлены. Известно, олнако, что важную роль в этом пропессе играют остатки пролина. В ролия яе молвят быть включенным в и-спираль (разве только одним концом), потому что пятичленное пирролидоновое кольцо просто не может в ней уместиться. В миоглобине содержится четыре остатка пролина и восемь окончаний п-спнральных участков. Ясно, что имеются и друь не факторы, определяющие завершение спирали.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
