М.И. Афанасов - Основы радиохимии и радиоэкологии. Практикум (1126999), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Все операциис радиоактивными растворами и пластинками проводят над кюветами, в халате и вперчатках. Пробы отбирают специальными пипетками и капиллярами. Использованные наконечники пипеток и капилляры помещают в стаканы для радиоактивных отходов. После завершения работы проверяют радиохимическую чистоту халата, перчаток и рук. Проверяют степень загрязненности поверхности кюветы. Для этого изме66ряют радиоактивность взятого «мазка» с помощью жидкостного сцинтилляционногоспектрометра или радиометра (см. работу 5).
При нештатной ситуации (загрязнениерадиоактивным веществом кожи рук, одежды, поверхности стола и т.п.) немедленнообращаются к преподавателю и под его руководством проводят дезактивацию.Цель работыХроматографическое разделение смеси аминокислот, меченных углеродом-14, иопределение их радиоактивности.Оборудование, материалы и реактивыСканер радиоактивности «БетаХром» (опытный образец, изготовленный в НИИ молекулярной генетики РАН);ЖС- спектрометр RackBeta 1215 (LKB Wallac) или TRI-CARB 1600 (PerkinElmer);хроматографические пластинки со слоем силикагеля (Silufol; Aldrich или Sorbfil);хроматографический стакан; микропипетки, капилляры, сцинтилляционные флаконы;растворы аминокислот: типичные набор - лизин (К), глицин (G), валин (V), лейцин(L), возможны и другие аминокислоты;смеси [14С]аминокислот;раствор нингидрина в ацетоне или этаноле;йодная камера;бутанол, уксусная кислота (98%), дистиллированная вода;сцинтилляционные жидкости Scintilene BD, Ultima Gold, ЖС-8 или другие.Выполнение работыГотовят элюент для хроматографии, смешивая бутанол, уксусную кислоту и дистиллированную воду в отношении 3:1:1 по объему.
Вдоль внутренней стенки хроматографического стакана размещают фильтровальную бумагу. Аккуратно наливают встакан приготовленный элюент в количестве, достаточном для погружения в негохроматографической пластики примерно на 0,5 см. Фильтровальную бумагу рекомендуется смочить элюентом, что должно привести к более быстрому подъему элюентапо пластинке и повысить воспроизводимость результатов.
Стакан закрывают стеклянной крышкой.Отрезают нижний край хроматографической пластинки шириной около 1 см и расчерчивают пластинку по образцу, приведенному на рис. 7.1. Стартовую линию проводят на расстоянии 10-12 мм от нижнего края пластинки, стараясь не нарушить слойсорбента. Вертикальные разделительные линии прочерчивают скальпелем, чтобыудалить слой сорбента. Ширина полосок примерно 15 мм. В верхней части пластинкиобозначают аминокислоты-стандарты и номер смеси меченых аминокислот, выданных для анализа.С помощью капилляра или микропипетки наносят на линию старта 1-2 капли растворов аминокислот-стандартов.
Надевают перчатки. Переносят хроматографическуюпластинку на кювету с радиоактивными растворами. С помощью капилляра или микропипетки наносят на линию старта 4 капли раствора смеси меченых аминокислот.Пластинку с нанесенными стандартами и радиоактивной смесью аминокислот ставятв хроматографический стакан. После этого можно снять перчатки, так как дальнейшие операции с хроматографической пластинкой не представляют опасности (активность нанесенного 14С незначительна).67Через 30-60 минут, когда элюент поднимется по хроматографической пластинкепримерно на 10 см, пластинку извлекают из хроматографического стакана, карандашом отмечают линию фронта элюента и высушивают.
Ножницами отрезают полоску,на которой проводили разделение смеси меченых аминокислот. Полоски со стандартами аминокислот опрыскивают раствором нингидрина или наносят раствор нингидрина на полоски с помощью пипетки. Пластинку, обработанную раствором нингидрина, оставляют при комнатной температуре до появления фиолетовых и краснофиолетовых пятен – продуктов реакции нингидрина с аминокислотами.
Для ускорения проявления пятен пластинку можно осторожно нагреть под лампой или в сушильном шкафу. При этом необходимо контролировать процесс, так как при «перегреве» нингидрин может окрасить всю пластинку. Контуры полученных пятен обводят карандашом и слой сорбента заклеивают скотчем.Внимание! Нингидрин вступает в реакцию с аминокислотами, входящими в состав белков кожи, окрашивая руки в красно-фиолетовый цвет. Рекомендуется выполнять операции с растворами нингидрина в перчатках.Рис. 7.1. Вид хроматографической пластинки, используемой в работе.Пояснения в тексте.При наличии йодной камеры положение веществ на пластинке можно определитьпо адсорбции паров йода.
Для полного удаления элюента пластинку сначала ненадолго помещают в нагретый сушильный шкаф, а затем - в йодную камеру до проявленияпятен на пластинке. Обнаруженные на пластинке пятна обводят карандашом.Определение радиоактивности аминокислот на пластинке с помощью сканерарадиоактивности:68Готовят ленту скотча, размер которой чуть больше длины хроматографическойпластинки. С помощью пипетки наносят 0,100,15 мл сцинтилляционной жидкостиScintilene BD на пластинку с радиоактивностью таким образом, чтобы жидкость равномерно пропитала слой сорбента от старта до фронта хроматограммы. Аккуратноприкладывают полоску сорбентом к липкой стороне ленты скотча, заворачиваютоставшиеся части ленты вокруг хроматограммы. Образованный скотчем футляр непозволяет испаряться сцинтилляционной жидкости и делает дальнейшую работу спластинуой безопасной. Под руководством преподавателя проводят сканированиехроматограммы на приборе «БетаХром».
Данные сканирования записывают в видетекстового файла.На хроматограммах стандартов определяют Rf аминокислот как отношение Rf = l/L,где l – расстояние от стартовой линии до центра пятна соответствующей аминокислоты; L – расстояние от стартовой линии до фронта элюента (см. рис. 7.1). С помощьюMicrosoft Excel или любой другой программы по математической обработке данныхстроят графики зависимости интенсивности сигнала от положения детектора над пластинкой (рис. 7.2). Так как программа Power Graph фиксирует время сканирования, тоРис.
7.2. Распределение радиоактивности по хроматографической пластинке,полученное из данных сканирования. Радиоактивность меченых соединенийпропорциональна площади пиков S1, S2 и S3.необходимо преобразовать время в расстояние с помощью коэффициента, определяемого делением длины отсканированной части хроматограммы на время сканирования.Определяют фоновую линию на графике, исходя из интенсивности сигнала до стартовой линии и выше фронта элюента. В идеале фоновые значения сигнала должны бытьпостоянны во всем интервале сканирования.
Однако часто наблюдается слабый дрейффоновой линии, связанный с тем, что сканирование начали, не дождавшись выходаФЭУ на стабильный режим работы. В этом случае требуется экстраполяция фоновойлинии некоторой функцией, что поможет точнее определить площади пиков на гра69фике. На полученном графике идентифицируют пики радиоактивности аминокислот(по величинам Rf) и определяют площади пиков, суммируя значения интенсивностисигнала в пределах пика за вычетом фона, определяемого по огибающей (см.
рис. 7.2).Рассчитывают процентное соотношение радиоактивностей аминокислот, находящихся в исследуемой смеси:%( X ) SX – площадь пика аминокислоты X;SSX100% S X ,i(7.1), гдеiX ,i– сумма площадей пиков всех аминокис-iлот, идентифицированных на хроматограмме.Определение радиоактивности аминокислот на пластинке с помощью ЖСспектрометраВозможно два варианта выполнения работы. В первом варианте пластинкусмачивают сцинтиллятором и заклеивают скотчем, как описано в разделе по работе сосканером радиоактивности. Затем пластинку размечают с помощью линейки и фломастера на узкие полоски шириной 5-10 мм, разрезают и с помощью пинцета помещают полоски в сцинтилляционные флаконы так, чтобы они располагались слоемсорбента вверх.
Флаконы закрывают крышками, на которых фломастером указываютномера изучаемой смеси аминокислот и номера полосок хроматограмм. Проводят измерение радиоактивности флаконов с помощью ЖС-спектрометра. Строят гистрограмму распределения активности по длине хроматографической пластины (MicrosoftExcel или OriginPro).Во втором варианте пластинку с разделенной смесью меченых аминокислотсначала ненадолго помещают в нагретый сушильный шкаф для полного удаленияэлюента, затем помещают в йодную камеру на 1-3 минуты до проявления пятен напластинке. Обнаруженные на пластинке пятна обводят карандашом. Пластинку сновапомещают в сушильный шкаф и нагревают для удаления йода. Затем пластинку заклеивают скотчем, участки пластинки с пятнами аминокислот вырезают, помещаютво флаконы и добавляют к ним сцинтилляционную жидкость в количестве, котороеукажет преподаватель.
Закрывают флаконы крышками, на которые наносят соответствующие обозначения. Проводят измерение радиоактивности флаконов с помощьюЖС-спектрометра. Рассчитывают процентное соотношение радиоактивностей аминокислот, находящихся в исследуемой смеси.70РАБОТА 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕГИСТРАЦИИ ТРИТИЯИ УГЛЕРОДА-14 ПО СПЕКТРАМ, ПОЛУЧЕННЫМ С ПОМОЩЬЮЖИДКОСТНО-СЦИНТИЛЛЯЦИОННОГО СПЕКТРОМЕТРАВ настоящее время в научных исследованиях в области химии и биохимии широкоиспользуются соединения, меченные 3H и 14C. Одной из причин этого является то, чтоуказанные радионуклиды можно ввести практически в любую органическую молекулу. Кроме того, при работе с 3H и 14C, испускающих при распаде низкоэнергетические-частицы, практически не требуется защита от внешнего облучения, что упрощаетпроведение эксперимента.
Вместе с тем надежная регистрация излучения 3H и 14Cвозможна только с помощью жидкостно-сцинтилляционных спектрометров(ЖСспектрометров). Для этого раствор препарата смешивают с органической жидкостью (сцинтиллятором), обладающей способностью преобразовывать энергию излучения в кванты света видимой области спектра. С помощью ФЭУ световые импульсы преобразуются в электрический сигнал, который после усиления и дискриминациификсируется в памяти спектрометра.
В итоге регистрируется распределение импульсов по энергиям, то есть определяется спектр излучения.Основой сцинтиллятора (растворителем) обычно используют ароматические углеводороды (толуол, ксилолы). Ранее в качестве основы сцинтиллятора широко использовали раствор нафталина в диоксане. Для придания способности преобразовыватьэнергию излучения в кванты света видимого диапазона к растворителю добавляютвещества-сцинтилляторы: 2,5-дифенилоксазол (РРО), 2,5-дифенил-1,3,4-оксадиазол(PPD), 2-(4-бифенилил)-5-фенилоксазол (PBO) и др.
Для корректировки испускаемогоспектра фотонов в область, наиболее соответствующую максимальной эффективности фотокатода ФЭУ, используют также добавки вторичных сцинтилляторов. Наиболее широко для этих целей применяется 1,4-бис-2-(5-фенилоксазолил)бензол(POPOP). В настоящее время в состав коммерческих сцинтилляционных жидкостей вкачестве растворителя используют 1,2,4-триметилбензол (псевдокумол), диизопропилнафталин, фенилксилилэтан, додецилбензол. Для того чтобы сцинтилляционнаяжидкость хорошо смешивалась с водными растворами, в нее добавляют поверхностно-активные вещества (ПАВ) как неиногенные (например, эфиры полиэтиленгликоляи алкилфенолов), так и ионные.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
