Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 81
Текст из файла (страница 81)
Используют два тина антител: палнклональные и моноклональные. Полнклональные антитела образуются множеством разных В-лнмфоцитон и ответ на конкретный антиген, например, при введении определенного белка в организм животного. Такие В-лимфоциты образуют антитела, связывающие специфические, но разные эпигоны антигена.
Таким образом, ноликлоналгс ныс препараты представляют собой смесь антител. узнающих разные участки белка. Напротив, моноклональные антитела синтезируются популяцией идентичных В-клеток (клоном), выращенных в клеточной культуре. Эти антитела гомогепцы, в том смысле что онн связглваютсн с одним и тем же эпигоном. Методы получения мопоклональных антител были разработаны Георгом Келс)юм н Сезаром Милынтсйном. Специфичность антител находит практическое применение. Оцределенныс антитела можно соединить ковалентной связью с носителем и использовать для колоночной хроматографии (рис.
3-1?, в). При пропускации через колонку смеси белков антитела будут специфическим образом связывать только определенные белки н удерживать их на колонке, н то ирсмя как остальные белки будут вымыватьсн. Искомый белок затем можно смыть с колонки раствором соли нли лругого реагента. Это мощный л~етод, использующийся для очистки белков. В другом универсальном аналитическом методе к антителам пришивают радиоактивную 5.2 Коиплеиентариое взаимодействие иежду бепиани и ли>андами: иииунная система и имиуиоглобулины (2551 1 2 3 4 5 6 -66,2- Щ и , эйгл -45,0- -31,0- -21,5- -14,4- Я>5-гель Иммуноблот и ИгРЛ б Рис.
5-26. Аналитические методы с использованием антител. Специфическое взаимодействие антитела с антигеном лежит в основе целого ряда методов, использующихся для идентификации и количественного анализа белков в сложных смесях. а) Схематическое представление общего подхода. 6) Определение антител против вируса простого герпеса (НЗЧ) в крови методом ИФА. Лунки покрывают антигеном НЗЧ, с которым связываются антитела против НЗЧ. В качестве вторичных антител используют антитела против 1д6 человека. конъюгированные с пероксидазой хрена. Последовательность шагов приведена на рис. а; чем больше антител против Н5Ч содержится в образце крови, тем выше интенсивность желтой окраски в лунке.
в) Иммуноблот. На дорожках 1-3 нанесены образцы протеинкинаэы, полученные на последовательных стадиях очистки. После проведения ЗВ5-электрофореза гель был окрашен с помощью красителя Кумасси синего. На дорожках 4-6 нанесены те же образцы, которые после электрофоретического разделения были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. Затем мембрану в определенных условиях обработали антителами против протеинкиназы. Цифры между фотографиями геля и мембраны указывают расположение маркерных белков с известными молекулярными массами (кДа).
иетку нли другой маркер, позволяющий легко их идентифицировать. При связывании антител с исследуемым белком по метке можно судить о наличии белка в растворе илн о его локализации в геле илн даже живой клетке. Некоторые мето- ф Инкубапия с первичными антитслами против искомого антигепа. (4) Иикубапия с комплексом антитеза>>фермент, связывая»нил> псрвичныс антитела. (5) Добавление субстрата. с) ((>) Образование окрашснноп> продукта указывает ~> ° на присутствие искомого антигена, ды, используя>щне данный подход, проиллюстрированы на рис.
5-26. Метод твердофазного нммуноферментного анализа ИФА, нлн ЕЕ!НА (от англ. епгугле11пяе>т зттиполог1>епс азизу), позволяет прове- 12561 Часть 1. 5. Функции белков сти быстрый количественный анализ антигена в образце (рис. 5-26, б). Образец белка наносят па инертную поверхность; чаще всего для этой цели используют 96-луночный полистирольпый планшет. Затем лунку промывают раствором недорогого и неспецифического белка (часто используют казсип из обезжиренного сухого молока), чтобы предотвратить адсорбцию белков, добавляемых на следующих стадиях. После этого в лунку вносят раствор первичных антител — антител против искомого белка.
Несвязанные антитела отмывают и добавляют раствор антител против первичных антител с ферментативной меткой, позволяющей щюводить реакцию с образованием окрашенного продукта. Оставшиеся в растворе вторичные антитела отмывают и добавляют субстрат для связанной со вторичными антитслами ферментативной метки. Количество образующегося продукта, определяемое по интенсивности окрашивания, пропорционально концентрации исследуемого белка в образце. В методе иммуноблоттинга (или вестернблоттипга) белки, предварительно разделенные с помощью злектрофореза, цод действием электрического тока переносят из геля на нитроцсллюлозпую мембрану (рис. 5-26, в). Мембрану блокируют неспецифическим белком, как при проведении ИФА, а затем последовательно обрабатывают первичными антителами, вторичными антителами с ферментативной меткой и субстратом. Окрашенный продукт образуется только в тех полосах, где содержится искомый белок.
Иммуноблоттинг позволяет детектировать минорные компоненты белковых смесей и приблизительно определять молекулярную массу исследуемого белка. ° Иммуиобиоттииг В следующих главах мы еще столкнемся с другими аспектами действия антител. Они играют чрезвычайно важную роль в медицине и люгут многое сообщить об особенностях белков и генов.
Краткое содержание раздела 5.2 КОМПЛЕМЕНТАРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ БЕЛКАМИ И ЛИГАНДАМИ: ИММУННАЛ СИСТЕМА И ИММУНОГЛОБУЛИНЫ ° Иммунный ответ определяется действием специализированных лейкоцитов и связанных с ними белков. Т-лимфоциты синтези- руют Т-клеточные рецепторы. В-лимфоциты синтезируют иммуноглобулины. В процессе клональпой селекции Т-хелперные клетки индуцируют нролифсрацию В-клеток или цитотоксических Т-клеток, вырабатывающих соответственно иммуноглобулины или Т-клеточные рецепторы, способные связывать определенный антигон.
° У человека обнаружено пять классов иммуноглобулинов, каждый из которых выполняет свою биологическую функцию. В количественном отношении преобладает 1КС. Молекулы 1КС имеют х'-образную форму и состоят из двух тяжелых и двух легких цепей. На двух концах молекулы, каждый из которых образован одной тяжелой и одной легкой цепью, расположены гипервариабельные области, формирующие два аптигенсвязывающих участка.
° Каждый иммупоглобулин обычно связывается только с одним участком большого антигена (например, белка) — с эпитопом. Процесс связь|вания часто сопряжен с конформациоиными изменениями, приводящими к пндуцироваппому соответствию между антитслом и антигоном. 5.3. Энертозависимые взаимодействия белков: актин, миозин и молекулярные моторы Живые организмы движутся. Клетки движутся. Органеллы и макромолекулы внутри клеток тоже движутся. Основная часть этих движений возможна благодаря активности удивительного класса белков — молекулярных моторов. С помощью химической энергии, источником которой обычно служит АТР крупные агрегаты моторных белков претерпевают циклические конформационные изменения; эти изменения складываются в унифицированные, направленные воздействия — от крошечных, разводящих хромосомы в делящейся клетке, до невероятной силы, которую развивает в прыжке камышовый кот весом до двадцати килограммов.
Взаимодействия между моторными белками, как вы уже можете предсказать, являются резуль- 5.3 Энергозависимые вэаимодейсгвия белков: актив, миоэин и молекулярные моторы [2571 Две сУиеРекРУчеввые «овец Легкие в"свирели цени Миозвв ц!>Н>ги!! Твжелый меромиозив .„' Лег«ий меромвозив «!$И»!$« Э! 52 ',">, Я1 татом ионных, гидрофобпых, вап-дер-ваальсовых взаимодействий и водородных связей в центрах спязывапия на молекулах белков. Однако в моторных белках эти взаимодействия достигают невероятно высокого уровня пространственной и временной организации.
Действие моторных белков лежит в основе сокращения мышц, перемешсния оргаиелл вдоль мпкротрубочек, врашения жгутиков бактерий и пвижсиия некоторых белков вдоль пити ДНК. Белки кипезииы и динеины движутся вдоль микротрубочек в клетке и тянут за собой органеллы или перестраивают хромосомы в процессе деления клетки.
Взаимодействие динсина с микротруб<>чками вызывает движение ресничек и жгутиков эукариотических клеток. Движение жгутиков бактерий связано с активиостыо сложпого врашательис>го мотора в основании жгутика (рис. 19-39). На различных этапах метаболизма ДНК-хеликазы, полимеразы и другие белки должны перемешаться вдоль молекулы ДНК (гл. 25). В даниой главе иа примере хорошо известных сократительных белков скелет»ых мышц позвоночных мы рассмотрим, каким образом белки превращают химическую энергию в движение. Миозин и актин — основные белки мышц Движущей силой мышечных сокрашений является взаимодействие двух белков — миозипа и актива. Эти белки организованы в виде нитей, скольжение которых друг относительно друга приводит к сокрашению мышц.
Вместе актив и мпозии составляют более 80% белковой массы мышц. Миозии(М,-540 000) состоит из шести полипсптидиых цепей — двух тяжелых (М, - 220 000) и четырех легких (М, - 20 000). Тяжелые цепи сопавляют основу структуры миозина. С-коццы тяжелых цепей организованы в виде протяженных а-спиралей и переплетаются между собой, образуя левую суперскручециую спираль, иапомппаюшую спираль о.-кератина (рис. 5-27„а). На К-конце каждая тяжелая цепь содержит большой побулярв домен с участком, иа котором происходит гидролиз АТР С глобуляриыми доменахп связаны легкие цепи. При быстрой обработке протеазой трипсииом длинный «хвост» молеку!>ы миозииа расшепляется, в результате чего образуются лва фрагмента, иазываемые тяжелым и 1т нм «Н>ловки» 1ЗО нм '.
Сз«ове>г вм «Хвост» Рис. 5-27. Миоэмн. а) Миоэии имеет две тяжелые цепи (изображены раэиыми оттенками розового цвета), С-коицы которых образуют протяженные суперскручеиные «хвосты», а Н-коицы содержат глобувяриые домены («головки»). С каждой «головком» ииоэмиа связаны две легкие цепи (похаэаиы синим цветом).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
