Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Очистка фермента. Биохимик исследует и выделяет новый ферлтснт. Результаты проведен- ной очистки сведены в таблицу. 1. Грубый экстракт 2. Осэждение солями 3. Осэжление под действием рН 4. Ионообменцая хроматография 5. Аффинпая хроматография 6. Гель-фильтрацин а) Из приведенных в таблице данных рассчитайте удельную активность фермента после каждой стадии очистки. б) Какая из стадий очистки была наиболее эффективной (т. е. позволила достичь наибольшего относительного увеличения чистоты)? в) Какая из стадий была наименее эффективной? г) Есть ли в приведенных данных какие- либо указания на то, что после стадии 6 белок полностью очищен? Что егпе нужно сделать, чтобы оценить чистоту ферментативного препарата? 16.
Диализ. Очищенный белок получен в буфере Нерез (й(-(2-гидроксиэтил)пиперазин- Х'-(2-этансульфоновая кислота)), рН 7, содержащем 500 мМ )т)аС!. Образец раствора белка (1 мл) помещают в днализный мешок и диэлизуют против 1 л того же буфера, но без ХаС!. Небольшие молекулы и ионы (такис как Ха', С! и Нерез) могут проходить сквозь мембрану, а белок не может. а) Какова концентрация )т(аС! в образце белка после установления лиализного равновесия? Считайте, что в процессе диализа объем раствора белка не изменяется. б) Какой была бы концентрация соли в растворе белка, если бы тот жс образец белка объемом 1 мл диализовали последовательно [166[ Часть 1. 3.
Аминокислоты, пептиды и белки дважды относительно 100 мл того же буфера Нерез? 17. Очистка пептида. Три пептила с указанным ниже аминокислотныл~ составом смывают с колонки, заполненной катионообменной смолой, при рН 7,0. В каком порядке пептиды будут сходить с колонки? Пептид А: А!а 10%, С1п 524, 5ег 5Ж, 1.еп 10",4, Агд102о, Н1з 5;4, Пе 10Ж, РЬе 524, 1уг 5;4, 1 уз 10Ж, С!у 10%, Рго 5Ж и Тгр 10",4. Пепгид В: А1а 5;4, Ча! 5%, С!у 1024, Азр 5Ж, 1.еп 5Ж, Агя 5%, Пс 5%, РЬе 5?4, Туг 5;4, 1.уз 5Ж, Тгр 5Ж, 5ег 5%, ТЬг 5;4, С!п 5;4, Азп 5?;, Рго 10;4, Мее 5Жи Сузб;4. Пептил С: А!а 10Ж, С!п 10;4, С!у 5Ж, 1еп 54 Азр 10%, Агя 5Ж, Мес 5?4, Сух 5%, Туг 5;4, РЬе 5Ж, Н1з 5;4, Ъа[ 5Ж„Рго 5Ж, ТЬг 5;4, 5ст 5Ж, Азп 5;4 и С!и 5Ж. 18.
Определение последовательности пептида лейэнкефалина„ выделенного из мозга. Из нормальной мозговой ткани была выделена группа пептидов, влияющих на передачу нервного импульса в некоторых отделах мозга. Эти пептиды называют опиоидами, поскольку они связываются со специфическими рецепторами, с которыми также связываются опиаты (алказонды опиума), такие как морфин и налоксон.
Таким образом, оп и онды имитируют не которые свойства оп патов. Некоторые ученые рассматривают эти вещества как содержащиеся в мозге собственные средства обезболивания. Используя приведенные ниже данные, определите аминокислотную последовательность опиоида лейэнкефалина Объясните, как предложенная вами структура согласуется с каждым из результатов (а — в). а) Полный гидролиз под действием 6 М НС! при 110 'С с последующим анализом аминокислот показал наличие в смеси С!у, 1.сп, РЬе и Туг в молярном соотношении 2:И:1. б) Хроматографический анализ, провелснный после обработки пептида 1-фтор-2,4- динитробензолом и полного гидролиза, выявил наличие 2,4-диннтрофенильного производного тирознна. При атом свободного тирозина обнаружено не было. в) Полное расщепление пептида под действием пепсина и проведенное затем хроматографичсское разделение показали наличие дипептида, содсржаепего остатки РЬе и 1.сп, и трипептида, содержащего Туг и С!у в соотношении 1:2.
19. Структура полипептидного антибиотика, выделенного из ВасИил Ьгетлл. Экстракты, полученные из бактериальной культуры Вас11- 1их Ьгесйлз содержат пептид, обладающий свойствами антибиотика. Этот пептил образует комплексы с ионами металлов и, по-видимому, нарушает систему ионного транспорта через клеточнук> мембрану у других видов бактерий, что приводит к их гибели. Структуру пептида установили на основании приведенных ниже результатов. а) Полный кислотный гидролиз полипептида с последующим анализом аминокислот продемонстрировал наличие эквимолярпых количеств [.еп, Огп, РЬе, Рго и та!. Огп — это сокращенное обозначение аминокислоты орнитипа, не встречающейся в белках, но присутствующей в некоторых пептидах. Орнитив имеет такую структуру: Н ! Н !Ч вЂ” СН.
— СН вЂ” Сн — С вЂ” СОО 2 2 2 2 ' !ЧН2 б) Молекулярная масса пентина оказалась приблизительно равна 1200. в) Пептил не подвергался гидролизу прв обработке ферментом карбоксипептидазой. Этот фермент катализирует отшепление любых С-концевых остатков, за исключением остатка Рго, а также за исключением тех случаев, когда остаток по какой-либо причине не солсржит свободной карбоксильпой группы.
г) Обработка исходного пептида 1-фтор-2,4- динитробснзолом с последующим полным гидролизом и хроматографическим разделением поюзали наличие только свободных аминокислот и производного следующего строения: !Чо. Н О~Н / л ЧН СН2 СН2 СН2 С СОО ' ЫН2 Вопросы и задачи !107] (Подсказка: учтите, что 2,4-динитрофенильная группа присоединена не как обычно к а-атому азота, а к аминогрупне боковой цепи.) л) Частичный гидролиз нептида, хроматогрэфпческое разлелсние продуктов и их аминокислотный анализ выявили наличие дн- и трипептидов следующего строения (аминоконцевые остатки всегда расположены слева): !еп-Р)>е Р1>е — Рго Огп — 1 еп 'уа! — Огп, Уа!-Огп — Есо Р1>е — Рго — Ъа! Рго — Ча! — Огп. Используя данную информацию, определите вмннокислотную последовательность цсптидного антибиотика.
Г!оясните ваши рассуждения. Объясните, как предложенная вами структура со>тасуется со всеми экспериментальными данными. 20. Эффективность секвенироваиия пептидов. Пентид с первичной структурой !уз-Агд — Рго — Сец — Пе- Лэр- О!у — А!а ссквенировалн но методу Эдмана. Каждая стадия цикла проведена с эффективностью 96%. Определите, какую часть всех аминокислот, высвобожденных в четвертом цикле, составляет лейцин? Каким будет зто значение при эффективности ю>жлого никла 99%? 21.Сравнениепоследовательностей. Белки,назым>емые молекулярными шанеронами (см. гл.
4), участвуют в процессе укладки (фолдинта) белков. Белки одного класса шапсронов, обнаруженные в ор>анизмах от бактерий до млскопитак>п>их, называют б>елками теплового шока 90 (Нзр90). Все шапероны Нвр90 содержат 10 характерных аминокислотпых последовательностей, которые позволяют легко идентифицировать эти белки в бизе данных. Два примера таких последовательностей представлены ниже. У-х-!>чанг>1-!к ни!-!В е1- !Ул~-е-!ем 1-и-! ег>1. "'1заеЯЯ~ Х С а) Какая аминокислота в данной послеловатсльности инвариантна (сохраняется во всех вилах организмов)? б) В какой позиции (каких позициях) располагаются только аминокислоты с положительно заряженными боковыми цепями? Для каждой из этих позиций определите, какая аминокислота встречается чаще других.
в) В какой позиции (каких позициях) располагаются только аминокислоты с отрицательно заряженными боковыми цепями? Для каждой из этих позиций определите, какая аминокислота встречается чаще других. г) В какой позиции может находиться любая аминокислота (хотя одна аминокислота все же встречается намного ча>це других)? Что это за позиция н какая аминокислота встречается здесь чаще остальных? 22. Биохимический протокол: ваша первая очистка белка. Придя впервые работать в биохимическую лаборатори>о, первые несколько недель вы учитесь мыть посуду н подписывать пробирки. Затем вам доверяют готовить буферные и запасныс растворы, необходимые для различных лабораторных нужд.
Наконец, вь> берете па себя ответственность за очистку первого белка. Это цитратсинтаза — фермент цикла лимонной кислоты, локализованный в митохондриях. Вы вынолняетс все перечисленные нижс стадии, следуя известному протоколу очистки.
Руководящий вами более опытный студент на каждой стадии очистки задает вопросы относительно смысла проведения этой стадии. Дайте ему ответы. (Подсказка: информацию об осмолярности см. в гл. 2; информацию о вылелении клеточных органелл см. с. 23). а) На ближайшей бойне вы получили 20 кг бычьих сердец. Вы перевозили их во льду и каждук> стадию очистки также выполняли на льду или в холодной комнате. С иоь>оп>ью специального гомогенизатора вы гомогенизировали сердца при РН 7„2 в буфере, содержащем 0,2 М сахарозу. Почему в качестве исхог)ного материала вы используете сердце быка и в таком большом количестве? Почему ткань нужно хранить па льду и разрушать при рН 7,2 в присутствии сахаровы? Что происходит с тканью при аомоеенизации? б) Вы подвергаете гомогенат ткани (плотный и непрозрачный) дифференциальному центрифугированию.
Зачем вы зто делаете? [>68~ Чзпь 1. 3. Аяинакислоты, пепткды и белки в) Для дальнейших экспериментов эы берете супернатант„который в основном содержит интактные митохондрии. Далее вы подвергаете митохондрии осмотическому лизису. Лизат имеет меньшую плотность, чем гомогенат, но все еше непрозрачен. Он состоит из митохондриальных мембран и внутреннего содержимого митохонлрий.
К этому лизату вы добавляете хорошо растворимую соль — сульфат амл>опия — в определенной концентрации, цептрифугируетс свою смесь, декаптируете супсрнатант и отбрасываете осадок. К сунернатанту, который выглядит более прозрачным, чем лизат, вы лобавлясте следующую порцию сульфата аммония и вновь центрифугируете образец. Но на этот раз вы сохраняете осадок, поскольку в нем содержится интересующий вас белок. Почему нужно добавлять соль дважды? г) Вы растворяете осадок, полученный при повторном осаждении сульфатом аммония, и проводите диализ в течение ночи против большого объема буфера с РН 7,2. Почему диализиый буфер ие содержит сульфата аммония? Почему вы используете буфер, а ие воду? д) Раствор после диализа вы наносите на колонку для гель-фильтрации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
