Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Следуя протоколу, отбираете первую сошедшую с колонки белковую фракцию и отбрасываете все остальные белки. Наличие белка во фракциях опрсделяетс по поглощению раствора в ультрафиолетовой области (при 280 нм). Что означает тот факт, что ваш белок сходит с колонки первым? Почему поглощение при 280 им является хорошим показателем наличия белка в растворе? е) Фракцию, отобранную при проведении предыдущей стадии, вы наносите на колонку для катионообменной хроматографии.
Вы отбрасываете весь исходный раствор, сошедший с колонки, и начинаете промывать колонку раствором с более высоким значением РН. Первую вышелшук> белковую фракцию отбираете. Обьясиите свои действия. ж) Вы наносите образец из вашей фракции, которая теперь сильно уменьшилась в размере и выглядит практически прозрачной (возможно имеет розоватый оттенок), на гель для изоэлектрофокусирования.
После провеления разделения и окрашивания геля вы видите на нем три широкие полосы. В соответствии с протоколом интересующий вас белок имеет значение р1 5,6. Но вы хотите подтвердить чистоту белка еще одним методом. Вы вырезаете из геля полосу с р! 5,6 и помешаете на полиакриламилный гель для проведения электрофорсза в присутствии 5П5. Почему вы ие уверены в чистоте белка, находящегося в отобранной вами полосе? Что вам могут сказать результаты Ягз-электрофореза? Почему важно проводить Ю5-злектрофорез после изозлектрофокусироваиия? Анализ экспериментальных данных 23.
Определение аминокислотной последовательности инсулина. На рис. 3-24 представлена аминокислотная последовательность гормона инсулина. Его структура бь>ла определена Фредериком Сенгером с сотрудниками. Большая часть этой работы опубликована в журнале ВгосЬет(са1 /оигпа1 в период с 1945 по 1955 г. Когда Сентер с сотрудниками начали этот цикл работ, было известно, что инсулин представляет собой небольшой белок, состоящий из двух или четырех полипептидных цепей, соелкнснных дисульфидными мостиками. Ученым удалось разработать несколько простых методов лля изучения последовательности белка. Обработка гП)ЧВ. ВПАВ (1-фтор-2,4- линитробснзол) реагирует со свободными аминогруппами (но не с амидо- или гуанидиногруппами) белка, образуя дицитрофенильные (П)ЧР) производные аминокислот: о,и о,н В Ь>нг э К >ЧОг Н Х ( > ИОг+ Нт н Линн г>>г Р-яло»> В>>МВ Кислотный гидролиз.
Кипячение белка с 1ОЖ-й НС1 на протяжении нескольких часов приводит к гидролизу всех пептидных и амидных связей. При краткой обработке образуются короткие пептиды; чем дольше обработка, теи полнее расщепление белка на составляющие его аминокислоты. Окисление цистеииа. При обработке белка надмуравьиной кислотой происходит расщепление всех дисульфидных связей, а все остатки цк- Анализ экспериментальных данных 11691 стеина превращаются в остатки цистеиновой кислоты (рис. 3-26).
Бумолгная хроматография. Эта наиболее примитивная версия тонкослойпой хроматографии (см. рис. 10-24) предназначена для разделения веществ на основании различии их химических свойств и позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты и, в некоторых случаях, дипептиды. Тонкослойная хроматография позволяет разделять пептиды более крупного размера. В своей первой работе (1945 г.) Сенгер обработал инсулин Г()1л(В, а затем подверг образовавшийся продукт гидролизу. Он обнаружил много свободных аминокислот, но лишь три ПИР— производных: о-ПИР-глицин (11ХР присоединен к гг-аминогруппе аминокислоты), а-П)л1Р-фенилаланин и в-ОХР-лизин (ОХР присоединен к е-аминогруппе).
Сентер интерпретировал этот результат таким образом, что инсулин состоит из двух белковых ценен: одна имеет на Х-конце Иу, а другая имеет на 1в-конце РЬе. Одна из двух цепей, кроме того, содержит остаток 1.уз, но не на 1л1-конце. Сенгер назвал цепь, начинающуюся с остатка Иу„ цепью А, а цепь, начинающуюся с остатка РЬе, цепью В. а) Объясните, как Сенгер пришел к этим выводам. б) Соответствуют ли данные результаты известной на сегодняшний день структуре инсулина (рис. 3-24)? В более поздней статье (1949 и) Сенгер описывал, как данный метод позволил ему определить несколько аминокислотных остатков в начале каждой цепи инсулина (с Х-конца). Например, при анализе последовательности цепи В он проделал следующие шаги.
1. Окисление инсулина для разделения цепей А я В. 2 Приготовление чистого образца цепи В с помощью бумажной хроматографии. 3. Проведение реакции цепи В с ГОХВ. 4. Мягкий кислотный гидролиз продукта с целью получения нескольких коротких пептидов. 5. Разделение ОХР-производных пептидов от пептидов, не содержащих ПИР-групп. 6.
Выделение четырех ОХР-пептидов, названных В1, В2, ВЗ и В4. 7. Полный гидролиз каждого ОХР-пептида с целью получения свободных аминокислот. 8. Идентификация продуктов гидролиза каждого пептида с помогцью бумажной хроматографии. Были получены следующие результаты: В1: только а-ОХР-фенилаланищ В2: а-ОХР-фенилазанин и валин; ВЗ: аспарагиповая кислота, гг-1)ХР- фенилалапии и валин; В4: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, сл-Пл(Р-фснилаланин и валин в) Основываясь на этих результатах, назовите четыре первые аминокислоты на )л1-конце пептида В. Объясните свои рассуждения. г) Согласуются ли эти результаты с известной последовательностью инсулина (рис. 9-24)? Объясните все несоответствия.
Сентер с коллегами использовали свой метод для определения полной последовательности цепей А и В. Они установили следующую последовательность А цепи (Х-конец расположен слева): л в ге С1у-11е-Ча1 — СНх-Их — Сув-Сув-А1а-Бег-Ча!- лв ю Сув — Бег — Ееи — Туг — Ях — 1.еи — Сгх — Авх — Туг — Сув — Авх Поскольку при кислотном гидролизе все остатки Авп превращаются в Авр, а все остатки С!п — в С! п, эти остатки пришлось обозначить Азх и С!х соответственно (точно их идентифицировать было невозможно). Сенгер решил эту проблему, разбив последовательности на короткие пептиды с помощью протеаз, расщепляющих пептидные связи, но не расщепляющих амидные связи в остатках Азп и С1п.
Далее он определил число амидцых групп в каждом пептиде, измеряя концентрацикэ ХН,', выделяюплегося при кислотном гидролизе пептида. Ниже представлены некоторые результаты, полученные для цепи А. Возможно, пептиды не были полностью своболны от примесей, так что эти цифры не абсолютно точные, ]170] Часть1. 3. Аминокислоты, пептиды н белки Кап ичестио Последа нетели ности аминокислот Натиоиие пептндл лмиднмх групп и пеппгде Ас! Ар)5 Ар)4 Ар5 Ар( Ар5ра1 Ар5 Сух-Аах Туг — С!х — !.еп Туг — С!х- 1еп — С!х Аах-Туг — Сух--Ахх Сах — Ахх — Туг — Суд — Ахх С!у — Пе — Ча! — С1х С!у — 1!е — Ча! — Сг!х-С!х — Суа — Сут— А!а -5сг — Ча! — Сух — Всг — (сп 0,7 0„98 1,06 2,10 1,94 0,15 но достаточно точные лля решения поставленной Сенгером задачи.
д) На основании этих данных определите аминокислотную последовательность цепи А. Объясните свой ответ и сравните его с данными, представленными на рис. 3-24. Литература Яапаег, Е (1945) ТЬс (гсс апина ягопрн о1 !пдп!)п. ВдкЛет, 7. 39, 507 — 515. Бапигт, Е (1949) Т!гс гспшпа! рсргЫсл а()пьп 1ш. Вилаем. Л 45, 503 — 574. озможно, наиболее замечательным свойством (миоглобина) являет го сложность н отсутствие симметрии.
Его организация кажется начи лишенной какой бы то ни было регулярности, которую инстннктив жидаешь найти, и оказывается гораздо более сложной, чем предсказ ет любая структурная теория белка. Джон Кендрю. Из статьи в журнале Иатпге, зр трехмерная структура белков 4.3.Третичная и четвертичная структуры белка 184 4.4. Денатурация и фолдинг белка 208 4.1. Обзор белковык структур 172 4.2. Вторичная структура белка 1ТТ стов типичного белка обусловлен образованием сотен ковалентпых связей. Вокруг многих из этих связей возможно свободнее эра~ление, поэтому молекула белка может принимать бесчисленное множество различных конформаций. Однако каждый белок несет специфическую химическую или структурную функцию, для реализации которой необходимо, чтобы он имел строго определенную трехмерную структуру (рис. 4-1).
В конце 1920-х гг. были получены кристаллы некоторых белков, в тои числе гемоглобина (М, = 64 500) и фермента уреаэы (М, = 483 000). Учитывая, что упорядоченное расположение молекул в кристалле обычно возможно лишь при идентичности этих молекул„кристаллическое состояние очень многих белков доказывает, что даже самые крупные пелки состоят из дискретных химических единиц с определенной структурой.
Этот вывод в свое время полностью изменил взгляд па белки и их функции. Рис. 4-1. Глобулярная струкгура химотрипсина. Чтобы дать представление о размерах, рядом с молекулой хнмотрипсина изображена молекула глицина. Известные трехмерные структуры белков хранятся в специальных банках данных (Рготе!п Вата Ваяй, РВВ; си. доп. 4-4). Изображение взято из банна данных РВВ (60СН). В данной главе мы обсулим, каким образом аминокислотная последовательность полипептидной цепи определяет трехмерную структуру белка.
В связи с этим рассмотрим пять основных вопросов. Во-первых, трехмерная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью. Во-вторых, функции белка зависят от его структуры. В-третьих, выделенный белок обычно существует в одной или нескольких стабильных структурных формах. В-четвертых, наиболее важный вклад в стабилизацию специфической структуры белка вносят не ковалснтные, а [$72~ Часть 1. 4. Трехмерная структура белков другис взаимодействия. Наконец, в-пятых, среди огромного числа уникальных белковых структур можно выделить некоторые общие типы, помогающие понять принципы архитектуры белковых молекул. Вынося на обсуждение эти темы, мы вовсе не имели в виду, что у белков статичная, неизменная трехмерная структура.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
