Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_2 (1123307), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Решение вопроса о том„когда (или как часто) такая транскрипция должна происходить. представляет собой более сложную и значительно менее понятную проблему. Как показано в гл. 39„два отдельных фрагмента ДНК в комплексе со специфическими связывающимися белками определяют именно эти «где» и «когда». В предельном случае, когда транскрипция находится на нулевом уровне„вопросы «где» и «когда» не имеют особого смысла, поскольку транскрипция не начинается вовсе. Поэтому сигнал типа «где» является потенциальным сигналом, не имеющим смысла в том случае, если сигнал «когда» принимает значение «не сейчас». Как показано в гл.
38„в хроматине ядра можно выделить как достаточно обширные транскрипционно-неактивные области (конститутивно или факультативно), так и области потенциально- активного хроматина. Кроме того, как отмечалось в гл. 38, мстилирование дезоксицитидиновых остатков ДНК может приводить к значительным изменениям хроматипа, препятствующим его транскрипции. Например, в клетках печени мыши экспрессируются только неметилированные рибосомные гены. Ряд данных указывает на то, что при метилировании ДНК вирусов животных она утрачивает транскрипционную активность. Однако из всего сказанного нельзя делать выводов общего характера о гом, что вся метилированная ДНК транскрипционно-неактивна, или, что весь неактивный хроматин метилирован.
или, что транскрипционноактивная ДНК обязательно не метилирована. Роль энхансеров В дополнение к крупным изменениям структуры хроматина, влияющим на транскрипционную активность, в молекуле ДНК существуют специфические сигналы-усилители, способствующие повышению эффективности транскрипции. Например, у вируса обезьян БЪ'40 промотору ранних генов предшествуют (на расстоянии около 200 пар оснований) две идентичные тандемные последовательности длинной 72 пары оснований, способные значительно усиливать экспрессию генов (и ч~о.
Эти так называемые знхансерные элементы (от англ. ю епЬапсе— усиливать) отличаются от промоторов двумя основными чертами. Они могут влиять на транскрипцию генов, даже будучи удалены от промоторов на тысячи пар оснований, и второе †усиливающий эффект не зависит от ориентации. Действие энхансеров имеет неспецифический характер — -они могут усиливать транскрипцию с любых доступных промоторов. Так, введение энхансерного элемента вируса ЯУ40 в плазмиду, несущую клонированный ген рглобина, может привести к 200-кратному усилению транскрипции этого гена.
Энхансерный элемент, судя по всему, не кодирует какого-либо специфического эффектора. непосредственно воздействующего на промотор, поскольку его действие проявляется только по отношению к промоторам, находящимся на той же молекуле ДНК, что и сам энхансер (цисэффект). В настоящее время уже выделены белки, связывающиеся с энхансерами. Изучение их функций, вероятно, поможет понять механизм действия этих регуляторных элементов. Эихансеры придают тем областям ДНК, где они расположены, гиперчувствительность к действию нуклеаз (см.
гл. 38). Уже выявлено много генов, обладающих энхансерами, расположенными самым различным образом относительно кодируюших участков. В дополнение к простому усилению транскрипции некоторые энхансерные элементы обладают тканевой специфичностью. Так, энхансер. расположенный между 3- и С-областями генов иммуноглобулинов, усиливает экспрессию этих генов преимущественно в лимфоид- 124 ных клетках. Энхансерные элементы генов панкреатических ферментов способны избирательно усиливать экспрессию сцепленных с ними чужеродных генов в клетках поджелудочной железы мыши (введенных в составе генно-инженерной конструкции на стадии одноклеточного эмбриона методом микрохирургии).
Таким образом, тканеспецифичная экспрессия генов может быть опосредована действием энхансеров или энхансероподобных элементов. Другие регуляторные элементы С помощью лигирования определенных областей ДНК. несущих предполагаемые регуляторные последовательности, с различными репортерными генами (метод слияния или конструирования химерных генов, рассмотренный в гл. Зб) можно определить, какой именно из участков ДНК, расположенных вблизи структурного гена, оказывает влияние на его экспрессию. Во многих случаях было показано, что последовательности, расположенные в 5'-области по отношению к старту транскрипции, оказывают весьма существенное влияние на частоту инициации транскрипции.
Рассмотрим в качестве примера металлотнонени — белок, связывающий тяжелые металлы н содержащий много остатков цистеина, который присутствует в большинстве органов млекопитающих. Если организм или культивируемая клеточная линия подвергаются обработке ионами металлов, таких„как цинк или кадмий, то наблюдается усиление транскрипции металлотионеинового гена и соответствующее повышение уровня белка металлотионеина, способного связывать потенциально токсичные ионы. С использованием методов генной инженерии стало возможным выделение области ДНК размером в несколько сот пар оснований, расположенной вблизи сайта инициации транскрипции гена металлотионеина.
К этому металлотноиеияовому регуляторному элементу можно присоединить другой структурный ген,например ген тимидинкиназы. Полученную химерную конструкцию можно ввести в культивируемые клетки, при этом в некой небольшой доли клеток реализуется встраивание чужеродной ДНК в геном. При обработке трансформированных таким образом клеток ионами тяжелых металлов наблюдается индукция тимидинкиназы с металлотионенинового промотора. Используя все более короткие участки исследуемой ДНК, можно точно определить положение искомого регуляторного элемента.
Недавно подобный эксперимент был проведен на мышах. Металлотионеиновый промотор присоединяли к структурным генам тимидинкиназы или гормона роста. Генно-инженерные конструкции были введены в пронуклеус одноклеточного эмбриона самца, а эмбрион в свою очередь был введен в матку мыши для последующего развития.
Мыши из полученного таким образом потомства отвечали на присутствие цинка в питьевой воде усилением экспрессии тимидинкиназы или гормона роста. В последнем случае трансгенные животные достигали вдвое большего размера, чем контрольные нормальные особи. Глюкокортикоиды — это класс стероидных гормонов, регулирующих экспрессию генов (см. гл. 44). При попадании молекул глюкокортикоидов в клетку млекопитающих они связываются со стероид-специфичным рецептором, который претерпевает при этом конформационные изменения в питоплазме и проникает в ядро.
Комплекс глюкокортикоид— рецептор взаимодействует со специфическим рецептор-связывающим сайтом ДНК в 5'-регуляторной области стероид-зависимых генов, например гена вируса рака молочной железы мыши, на расстоянии в несколько сот пар оснований от сайта инициации транскрипции. Посадка комплекса на рецептор-связывающий сайт, судя по всему, приводит к более эффективному использованию промотора РНК- полимеразой, усиливая таким образом экспрессию стероид-зависимых генов. Область ДНК, связывающаяся с гормон-рецепторным комплексом, также может быть клонирована и присоединена к другому структурному гену.
После встраивания таких химерных конструкций в геном культивируемых клеток млекопитающих репортерные структурные гены приобретают способность контролироваться содержанием глюкокортикоидов в среде, т.е. становятся стероид-индуцибельными генами.
Постепенно укорачивая нуклеазной обработкой концы клонируемого фрагмента и вводя в него мутации, можно идентифицировать районы ДНК, которые непосредственно участвуют в связывании с гормон-рецепторным комплексом. Создается впечатление, что связывание гормон-рецепторного комплекса с определенным участком ДНК превращает его в активный энхансерный элемент.
В ближайшем будущем мы, вероятно, сможем разобраться в молекулярном механизме точной регуляции экспрессии эукариотических генов, в частности на примере стероид-зависимых генов, Прнцессинг РНК кнк механизм регуляции экспрессии Помимо регуляции экспрессии генов путем воздействия на эффективность использования промотора эукариотические клетки обладают дополнительным механизмом контроля экспрессии генов, основанным на альтернативном пронессннге РНК. Существуют два общих типа контроля процессинга РНК: первый тип контроля основан на принятии решения о том, какие именно из первичных транскриптов вообще подлежат нронессннгу.
Второй тип— дифференциальный нронессннг. В отношении первого механизма очевидно, что первичные транскрипты, содержащие интроны, прежде, чем попасть в цито- 125 Регулчцкч зкгпрестап геапе Дифференциальный процессииг РНК Стабильность мРНК ц р -цепи содержит гидрофобный Стабильность молекул матричной РНК в цитонт, заканчивающийся последова- плазме представляет собой фактор, изменение кото- Конец секретируемого РЧ Ся! Ся2 Сиз Ся4 и М Экзоны ' — 3о — Ооск2-"""-ю '9~ гl 44,4 м Экзоиы С~а| Сд2 Саз Са4 Ал 'ч О д)х А„ онец секретируемого продукта 1Секретируемая) д -мРНК (Мембранная) д „-мРНК Ряс. 4!.15.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
