Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Михаэлис пришел к выводу, что скорость реакции достигает максимума при достаточно высокой концентрации субстрата, так как в этих условиях субстрат занимает все каталитические центры на ферменте. Это положение является самым старым и наиболее общим доводом в пользу существования ЕЯ-комплексов. 460 Рнс. 6.8. 600 660 Длина волны, пм При добавлении субстратов реакции-серина и ицдола-изменяется интенсивность флуоресценцин пиридоксальфосфатной группы в активном центре триптофан синтазы.
го субстрата — нндола — гасит флуоресценцию до уровня ниже исходного. Таким образом, флуоресцентная спектроскопия позволяет выявить существование комплексов фермент — серии и фермент — серии — нндол. Для изучения фермент-субстратного взаимодействия с успехом применяются и другие спектроскопические методы, в частности методы ядерного и электронного парамагнитного резонанса. 4.
При образовании Е8-комплекса проявляется высокая степень стереоспецифичности. Например, Р-серии пе молсетп служить субстратом для триптофан-синтазы. Более того, Р-нзомер даже не связывается с ферментом. Из этого следует, что участок связывания субстрата имеет строго определенную геометрическую форму. 5. ЕЯ-комплексы удается иногда выделитпь в чиспто.и виде. Если фермент катализирует реакцию А + В С, то в некоторзвх случаях можно выделить комплекс ЕА.
Для этого необходимо, чтобы фермент обладал достаточно высоким сродством к А и чтобы В в смеси отсутствовал. 6. При постоянной концентрации фермента скорость реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата, пока не будет достигнута максимальная скорость 6.8. Некоторые свойства активных центров Активный центр фермента-это участок, который связывает субстраты (н простетическую группу, если она есть) н в котором содержатся аминокнслотные остатки, непосредственно участвующие в образовании илн разрыве химических связей. Такие остатки называют каеалитпическими группами. Несмотря на огромное разнообразие структуры ферментов, их специфичности и механизма каталитического действия, все же можно сделать ряд обобщений в отношении свойств активных центров.
1. Оа активный центр приходится отпносительно малая частпь общего ойьема фермента. Большая часть аминокислотных остатков в молекуле фермента не контактирует с субстратом. Остается загадкой, поче- Максимальная скорость о о Концентрация отеетрьтв Рнс. 6.9. Скорость ферментативной реакции ках функция концентрации субстрата. 6. Введение в энзимолотню Рис.
6.10. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели ключ-замок. Активный центр фермента сам по себе комплементарен по форме субстрату. му размер ферментов так велик. Почти все ферменты содержат более 100 амннокислотных остатков и имеют массу свыше 10 кДа, а диаметр-свыше 25 А. 2. Активный центр — трехмерное обризоваяие. Другими словами, это не точка, не линия и даже не плоскость, а сложная трехмерная структура, в формировании которой участвуют группы, принадлежащие разным частям линейной последовательности аминокислот. Действительно, как мы уже видели на примере гемоглобина и миоглобина, взаимодействие между аминокислотными остатками, расположенными далеко друг от друга в линейной последовательности, нередко сильнее, чем взаимодействие между соседними (в последовательности) остатками аминокислот.
В лизоциме — ферменте, который мы рассмотрим подробно в следующей главе, основные группы активного центра представлены аминокислотными остатками, занимающими 35, 52, 62, 63 и 101-е положения в линейной последовательности из 129 аминокислот. 3. Субстраты относительно слабо связываюгпся с ферментами. Константы равновесия ЕБ-комплексов обычно ле:кат в пределах от 1О з до 10 в М, что соответствует свободным энергиям взаимодействия от — 3 до — 12 акал(моль.
Сравним эти величины с силой ковалентных связей, составляющей от — 50 до — 110 ккал(моль. Часть 1 110 Конформации н динамика 4. Активный центр имеет форму узкого углубления или и)вли, Во всех ферментах с изученной структурой связывание субстратов происходит в таком углублении или щели, куда нет доступа воде, за исключением тех случаев, когда вода является одним из реагирующих веществ. В этом углублении присутствует несколько полярных аминокислотных остатков, необходимых для связывания и катализа. Неполярный характер всей области в целом способствует связыванию субстрата.
Кроме того, щелевидная форма активного центра создает микроокружение, в котором отдельные полярные остатки приобретают особые свойства, существенно важные для катализа. 5. Специфичность связывания зависит огп строго определенного расположения атомов в акгпивиом центре. Субстрат входит в активный центр, только если он соответствует ему по форме. В 1890 г. Эмиль Фишер (Е. Г1вс)зег) использовал сравнение с ключом и замком (рис. 6.10), которое оказалось по существу правильным н исключительно плодотворным представлением о стереоспецифичности катализа. Однако, как показывают работы последних лет, активные центры некоторых ферментов не являются жесткой структурой, их форма модифицируется при связывании субстратов.
В этих ферментах форма активно~о центра становится комплементарной форме субстрата Рнс. 6.11. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели индуцированного соответстия. При связывании субстрата происходит изменение формы фермента. Активный центр фермента только после присоединения субстрата становится комплементарным ему по форме. Я й .У .„(г Е В о Концвнтрация субстрата [я График зависимости скорости реакции У от концентрации субстрата [Б3 для фермента, подчиняющегося кинетике Мнхаэлиса — Ментен (У .„— максимальная скорость, Км— константа Мнхаэлиса).
Рне. 6.12. только после связывания субстрата. Такой процесс динамического узнавания называют иидукз)ией соонзвемствия (рис. 6.11). Кроме того, некоторые ферменты предпочтительно связывают субстрат в напряженной («искаженной») форме, соответствующей переходному состоянию. Фермент Е соединяется с субстратом Б, образуя ЕБ-комплекс; константа скорости этого процесса — й,.
Судьба ЕБ-комплекса складывается двояко: он может либо диссо- 6.9. Кинетина многих ферментов описывается моделью Михаэлиса — Ментеи Для многих ферментов скорость катализа К таким образом, зависит от концентрации субстрата [Б3, как это показано на рис. 6.12. При постоянной концентрации фермента и малых значениях [Б3 Упочти прямо пропорциональна [Б3. При высоких значениях [Б3 1'почти не зависит от [Б). В 1913 г. Леонор Михаэлис и Мод Ментен (Ь. М(с)зае1(з, М. Мептеп) предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Основная их посылка состояла в том, что образование специфического фермент-субстрапюго комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа.
Предложенная ими модель, которая простейшим образом описывает кинетические свойства многих ферментов, состоит в следующем; 22 22 Е+Б ю ЕБ- Е+ Р. 22 Скорость образования ЕБ = )(з [Е3 [Б3. (3) Скорость распада ЕБ =(йз+ Йз) [ЕБ3. (4) Определим скорость катализа в стационарных условиях. Стационарные условия характеризуются тем, что концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрации исходных и конечных продуктов меняются.
Это имеет место в том случае, когда скорость синтеза ЕБ-комплекса оказывается равной скорости его распада. Если левые части равенств (3) и (4) равны между собой, то равны и правые, т. е. 1 [Е3[Б) =(йз+ йз) [ЕЯ. Преобразуем это уравнение: (5) [чя ((гз + "з)2(22 (6) Уравнение (6) можно упростить, если ввести новую константу Км, называемую констан- той ззтихаэлиса: "з + (гз Км= /Гз Введем Км в уравнение (6): [Е) [Б) '"'- Км (8) 6.
Введение в зизнмологию циировать на Е и Б с константой скорости )г„либо подвергаться дальнейшему превращению, образуя продукт Р, с константой скорости )гз. Постулируется, что продукт реакции Р не превращается в исходный субстрат Б; это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта не достигает ощутимого количества. Как связана скорость катализа с концентрацией субстрата и фермента и скоростями отдельных этапов реакции? Начнем с того, что скорость ферментативной реакции равна произведению концентрации комплекса ЕБ на константу )гз: У=(з [ЕБ3.
(2) Выразим [ЕБ3 через известные величины. Скорости образования и распада ЕБ составляют: Изображение кинетики ферментативной реакции на графике двойных обратных величин: 1/Р выражена как функция 1/[0). Наклон кривой равен Км/г',„, точка пересечения с осью у соответствует 1/Р„„о точка пересечения с осью х — 1/Км. Рис, 6.13. [Е) = [Ет) — [Еб). (9) Подставим это выражение в уравнение (8): [Еб) = ([Ет) — [Е8)) [8)~Км.
(10) Решение уравнения (10) относительно [Еб) дает [Еб) = [Е,) 1+ [а)!Км или Рассмотрим числитель в последнем выражении. Концентрация несвязанного субстрата [Я практически равна общей концентрации субстрата при условии, что концентрация фермента значительно ниже концентрации субстрата. Концентрация несвязанного фермента (Е) равна общей концентрации фермента Ет минус концентрация комплекса ЕБ: 1У(З) Максимальная скорость реакции 1',„постигается при насыщении активных центров фермента субстратом, т.е. когда [8) намного выше Км, при этом условии [8)Я8) + +Км) приближается к единице.
Следовательно, (юпал йэ [Ет) (14) Подставив это выражение в выражение (13), мы получим уравнение Михаэлиса- Ментен: (15) [8)+Км Это уравнение соответствует кинетическим данным, представленным на рис. 6.12. При низких концентрациях субстрата„когда [8) намного ниже Км, Р = [8) К .„!Км, т.е. скорость прямо пропорциональна концентрации субстрата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
