Изучение и опеделение оптимальных условий проведения денситометрического сканирования (1113659), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Удаление спластинки разделенных пятен, содержащих анализируемые вещества, элюирование их ссорбента и определение при помощи фотометрии раствора требуют много времени и необеспечивают достаточной правильности. Свой вклад в проблему вносят также трудностьточного определения края пятна при визуальном наблюдении, неполное элюирование13пробы с сорбента и неспецифическое фоновое поглощение из-за присутствия коллоидныхчастиц сорбента в анализируемом растворе. Кроме того, описанный выше процессслишком не удобен для того, чтобы рассматривать его в качестве приемлемого способадетектирования при высокоскоростном хроматографическом методе.
Аппаратура дляопределения веществ непосредственно на ТСХ-хроматограммах впервые появилась в 1967г. и в настоящее время считается необходимой для правильного определения размеров иположенияпятна,точногоколичественного анализа [2,8].измеренияразрешения,быстрогоиправильного144.
Экспериментальная часть4. 1. Приборы и реактивыВ качестве исследуемого соединения нами был выбран лекарственный препаратАнафранил (химическое название 3-Хлор-5-[3-(диметиламино)пропил]-10,11-дигидро-5Ндибензо(b, f)-азепин).Концентрация стандартного раствора Анафранила в гексане была 4.9 мкг/мкл.Растворы с меньшими концентрациями готовили последующим разбавлением.В качестве подвижной фазы для элюирования использовали смесь ацетонхлороформ-метанол-третбутиламин (2:7:1:0.2) [10]. Для нанесении пробы на ТСХпластины использовали микрошприцы объемом 1 и 10 мкл (Hamilton, США).Хроматографическое разделение проводили в вертикальной камере (Ленхром, Россия) напластинах Merck F-254 с зоной концентрирования (Merck, Германия). Размер пластин10×20 см, подложка стеклянная. Денситометрические измерения проводились наденситометре Camage TLC Scanner 3 c использованием программного обеспечения “Cats4” (Camage, Швейцария).
Измерения проводились в абсорбционном режиме сканирования(λ = 254 и 400 нм) с использованием дейтериевой и ртутной ламп в качестве источниковизлучения.4. 2. Построение градуировочного графикаИзмерения в тонком слое, необходимые для построения градуировочного графика,проводили в следующих условиях: ширина щели монохроматора 5 нм, размерысканирующей щели 6.0×0.45 мм, скорость сканирования 5 мм/с, разрешение 100 мкм. Этипараметрыавтоматическиустанавливаетпрограммаденситометраприначалесканирования в УФ-области.
В качестве источника излучения использовали дейтериевуюлампу, хроматографические зоны сканировали в режиме абсорбция/отражение.На стартовую линию тонкослойной хроматографической пластинки наносилиаликвоты (V = 3 – 4 мкл с концентрацией С = 4.9⋅10-8 г/мкл и V = 1 – 5 мкл сконцентрацией С = 4.9⋅10-7 г/мкл). Элюирование проводили в указанной подвижной фазе,затем пластины сушили в потоке теплого воздуха и сканировали хроматограммы вусловиях, указанных выше. Результаты измерений приведены в Таблице 1.15Таблица 1.
Данные для построения градуировочного графика АнафранилаС, мкг/зонаS пика, AU.0,01470,01960,0490,0980,1470,1960,245151,5268,51305,6726,01717,05880,375850,1Полученные результаты апроксимируются к прямой, задающейся уравнением S =31950.C – 319.05, с коэффициентом сходимости равным R2 = 0.9998. Градуировочныйграфик представлен на Рис. 1.4. 3. Определение оптимальных значений параметровсканирования в режиме абсорбции при определенииконцентрации вещества в пятнеНа стартовую линию тонкослойной хроматографической пластинки нанеслиаликвотураствораАнафранилаопределеннойконцентрации.Затем,послехроматографирования в подвижной фазе, провели денситометрическое сканирование,изменяя значения параметров сканирования.4.
3 .1. Определение оптимальной ширины щели монохроматораСканирование проводили при постоянных значениях скорости сканирования (5мм/с) и размеров сканирующей щели (3.0×0.1 мм). Результаты сканирования приведены вТаблице 2.Таблица 2. Зависимость определяемого количества вещества в хроматографическойзоне от ширины щели монохроматораШирина щели монохроматора, нмSпика , AUC, мкг/зона5204808,24652,10,16050,155616На основании полученных результатов, был сделан вывод, что оптимальнымзначением ширины щели монохроматора является 5 нм.4. 3. 2.
Определение оптимального значения скорости сканированияСканирование проводили при постоянных значениях ширины щели монохроматора(5 нм) и размеров сканирующей щели (3.0×0.1 мм). Результаты сканирования приведены вТаблице 3.Таблица 3. Зависимость определяемого количества вещества в хроматографической зонеот скорости сканированияСкоростьсканирования, мм/сSпика, AUC, мкг/зона0.515102040801005153,05103,15061,65047,05060,15053,45153,95226,20,17130,16970,16840,16800,16840,16820,17130,1736Полученные данные свидетельствуют о наличии зависимости между значениемплощади пика (следовательно, и определяемого количества вещества) и скоростисканирования.
Данная зависимость представлена на Рис. 2. Из рисунка видно, что криваяимеет два максимума при минимальном и максимальном значениях скоростисканирования. Наиболее оптимальным из них является 100 мм/с. Однако в случае, еслинеобходимонетолькопровестиколичественноеопределение,ноидобитьсямаксимального разрешения близколежащих пиков, значение 0.5 мм/с оказывается болеепредпочтительным (вывод сделан на основе нижеследующих экспериментов, см. Часть4.4).4. 3. 3. Определение оптимальных значений размеров сканирующей щелиСканирование проводилось при постоянных оптимальных значениях скоростисканирования (100 мм/с) и ширины щели монохроматора (5 нм).
Результаты приведены вТаблице 4.17Таблица 4. Зависимость определяемого количества вещества в хроматографической зонеот размеров сканирующей щели№группы1234567891011Размерысканирующей щели,мм12,0×0,912,0×0,612,0×0,412,0×0,210,0×0,910,0×0,610,0×0,410,0×0,28,0×0,98,0×0,68,0×0,48,0×0,26,0×0,96,0×0,66,0×0,456,0×0,46,0×0,36,0×0,26,0×0,15,0×0,455,0×0,35,0×0,25,0×0,14,0×0,454,0×0,34,0×0,24,0×0,13,0×0,453,0×0,33,0×0,23,0×0,12,0×0,22,0×0,11,0×0,21,0×0,10,5×0,20,5×0,10,25×0,1Sпика , AUC, мкг/зона1363,41386,31349,51406,91512,21599,91529,51649,11876,21955,81929,81951,72526,82580,82679,42452,72557,02578.72614,13243.23296,93067,03112,63933,53852,43821,43854,04775,34779,94661,54691,95206,05577,05459,36322,35962,36263,76365,00,05270,05340,05220,05400,05730,06010,05790,06160,06870,07120,07040,07110,08910.08850.09380.08680.09000.09070.09180.11150.11130.10600.10740.13310.13060.12960.13060.15940.15960.15590.15680.17290.18450.18090.20790.19660.20600.2092Строго говоря, существует основное правило выбора сканирующей щели приточечном нанесении раствора на хроматографическую пластину.
Ее длина должна быть18чуть больше диаметра пятна с тем, чтобы закрывать его целиком. При Сканирующая щельизменяется следующим образом. Существует 11 предлагаемых длин щелей: значения 12,10 и 8 мм относятся к макро-группе, значения 6 – 1, 0.5 и 0.25 мм – к микро-группе. Длякаждой длины щели имеется несколько (от одного до семи) вариантов ширины.
Как видноиз Таблицы 4, внутри каждой группы размеров происходят изменения определяемойплощади пика в зависимости от ширины щели. Так, например, в группах № 1 – 3максимальная площадь пика достигается при значениях ширины щели 0.6 и 0.2 мм. Всамой большой группе – № 4 – наблюдается резкий максимум определяемой площади прищели с параметрами 6.0×0.45 мм. Щель с такими параметрами выставляется программойпо умолчанию. В группах № 5 – 7 различия не столь заметны, однако увеличениеопределяемой площади пика наблюдается при значениях ширины щели 0.45 и 0.3 мм.
Впредпоследних трех группах закономерность меняется: чем уже щель, тем большеплощадь пика. В группу № 11 входит только один вариант параметров сканирующейщели, равный 0.25×0.1 мм. Он и является наиболее оптимальным для определенияколичества вещества в хроматографической зоне. Следует отметить, что при значенияхданного параметра в диапазоне 2.0×0.1 – 0.25×0.1 мм колебания базовой линии наденситограмме резко увеличиваются.198000y = 31950x - 319,05R2 = 0,9998S, AU 600040002000000,050,10,150,20,250,3мкг/зонаРис.
1. Зависимость площади пика от количества Анафранила в хроматографической зоне5300S, AU520051005000020406080100cкорость сканирования, мм/сРис. 2. Зависимость площади пика от скорости сканирования204. 4. Определение оптимальных значений параметровсканирования в режиме абсорбция для максимальногоразрешения пиков на хроматограммеПриразрешенияопределенииоптимальныхблизколежащихпиковзначенийвыводыпараметровделалинасканированияоснованиидлярезультатовсканирования бумажного листа с нанесенными на него черными линиями различнойтолщины, расположенными на определенном расстоянии друг от друга.
Четыре линиитолщиной 0,2 мм на расстоянии 1 мм друг от друга, две линии толщиной 0,5 мм нарасстоянии 2 мм и две линии толщиной 1 мм на расстоянии 5мм. Внешний вид листапредставлен на Рис. 3. Денситометрическое сканирование проводили при различныхзначениях параметров прибора с использованием в качестве источника излученияртутную лампу (λ = 400 нм).Рис. 3. Внешний вид листа, используемого для определения оптимальных условийразрешения соседних хроматографических пиков4. 4. 1. Определение оптимального значения ширины щели монохроматораСканирование проводили при постоянных значениях размеров сканирующей щели(6.0×0.45 мм) и скорости сканирования (100 мм/с). Последняя (дальняя) группа из 2-хполос разделялась при всех условиях, поэтому в таблицах под названием «последние двапика» подразумевалась средняя группа полос (см.
Рис. 3). Результаты сканированияприведены в Таблице 5.21Таблица 5. Зависимость разрешения соседних пиков на хроматограмме от шириныщели монохроматораШирина щелимонохроматора, нм520Разрешение, %.первые четырепоследние двапикапика40854085Из полученных данных следует, что изменение ширины щели монохроматорасущественно не влияет на разрешение, так как видимых изменений нет. Для дальнейшихисследований было выбрано значение 5 нм, поскольку это значение автоматическивыставляет программа денситометра.4. 4. 2. Определение оптимального значения скорости сканированияСканирование проводили при постоянных значениях размеров сканирующей щели(6.0×0.45 мм) и ширины щели монохроматора (5 нм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
