Готовая версия РНК (1113531), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Геномы многих вирусов бактерий (бактериофагов), животных и в более редких случаях растений представлены ДНК. Такие клеточные органеллы, как митохондрии и хлоропласты, имеют также свою собственную ДНК размером от несколько десятков до несколько сотен т.п.н.

Биосинтез ДНК осуществляется в результате репликации - точного самокопирования (самовоспроизведения) путем синтеза новой молекулы ДНК на исходной ("материнской"), которая играет роль матрицы. Этот процесс осуществляется под действием фермента ДНК-полимеразы. Матрицей для синтеза ДНК может служить также однотяжевая (одноцепочечная) РНК, комплементарное копирование которой осуществляет фермент обратная транскриптаза.

Современные методы хим. синтеза Н.к. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методические основы хим. - ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают: 1) хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из которых затем в результате комплементационных взаимодействий выстраиваются дуплексы - фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях; 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетических однотяжевых олигонуклеотидов проводят в несколько этапов. Сначала (а) собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (одно-тяжевыми комплементарными участками), из которых затем последовательно (б, в и т. д.) формируют более протяженные структуры. Таким образом могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетической инженерии возможно клонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусств. ДНК.

Схема синтеза полидезоксинуклеотида: 1,- соотв. 5'- и 3'-конец олигонуклеотидов; 3-комплементарные участки концов дуплексов (:липкие: концы); а,б и в-стадии образования дуплексов (все стадии катализируются Т4 ДНК-лигазой).

Синтез олигодезоксинуклеотидов Корана осуществил фосфодиэфирным методом по схеме:

К динуклеотиду со своб. 3'-гидроксильной группой присоединяют таким же способом динуклеотид с незащищенной 5'-фосфатной группой и т.д. (блочный метод синтеза):

Несмотря на малую эффективность этого метода, были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие до 16 звеньев, из которых были собраны первые синтетические гены. Фосфодиэфирный метод образования межнуклеотидных связей, использованный Кораной, имеет история, значение. Однако разработанные им приемы введения и избирательные удаления защитных групп широко используются в др. методах синтеза Н.к.

Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонуклеотидов явилась разработка фосфотриэфирного метода, который осуществляют по схеме:

Образующийся динуклеотид далее (после частичного деблокирования фосфата) конденсируют аналогичным образом с другим динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в котором используют защиту фосфатной группы, позволило значительно сократить время синтеза и повысить выходы олигонуклеотидов.

Параллельно этим методам, которые осуществляют в растворах, разрабатывались твердофазные способы синтеза Н.к. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в растворе.

Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью "якорной" группы к нерастворимому полимеру. Затем его 5'-гидроксильную группу деблокируют и конденсируют с нуклеотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата деблокируют защитную группу в положении 5' и присоединяют следующий нуклеотид и т.д.

Наиболее распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р(III). В амидофосфитном способе нуклеотидным компонентом является эфир 3'-амидофосфита дезоксинуклеозида. Достаточно устойчивые амидофосфиты при протонировании в присутствии тетразола превращаются в сильные фосфорилирующие агенты. Схема также включает блокирование непрореагировавшей 3'-гидроксигруппы достраивающегося олигонуклеотида (кэпирование) и окисление межнуклеотидного фосфита. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH₂ гетероциклов. Липофильную группу (МеО)₂Тr удаляют после первого хроматографические разделения.

Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом; П - полимерный носитель, Ру- пиридин.

Модель полимерной цепи

Модели полимерных цепей делятся на два типа: "идеальные" и "реальные" модели. Идеальная цепочка модели предполагает, что нет взаимодействия между цепями мономеров. Это предположение является правильным в отношении некоторых полимерных системах, где положительные и отрицательные взаимодействия мономера фактически отменены. Идеальная цепочка модели является хорошей отправной точкой для исследования более сложных систем и больше подходит для уравнений с большим количеством параметров.

Идеальная модель

Свободно присоединяющаяся цепь - простейшая модель полимера. В этой модели фиксированная длина полимерного слоя линейно связана, все химические связи и углы кручения равновероятны. Поэтому полимер может быть описан простым случайным блужданием и идеальной цепочкой.

Свободно вращающаяся цепь улучшает модель свободно присоединяющейся цепи, принимая во внимание тот факт, что у полимерных слоев фиксированный угол к соседней единице из-за конкретных химических связей. В соответствии с этим фиксированным углом сегменты все еще свободно вращаются, и более вероятно скручивание углов.

Есть предположение, что вращению модели мешает потенциальная энергия, которая сдерживает углы вращения. Вероятно, каждый угл кручения пропорционален фактору Больцмана:

В ротации изомерного состояния модель позволила углам кручения определять позиции в минимумах потенциальной энергии вращения. Химические связи длин и углов остаются постоянными.

Полимеры не являются достаточно гибкими, из-за изгибов и энергии. На нижней отметки шкалы длин сохраняется размер длины, полимер ведет себя более или менее жестким, как стержень.

Реальная модель

Взаимодействие между цепями мономеров могут быть промоделированы как разделение объема. Это приводит к сокращению конформационных возможностях цепи, и ведет к самостоятельном случайном блуждании.

1. Анализ особенностей молекулярных механизмов связывания малых РНК с матричной РНК, кодирующей последовательность аминокислот в белковых молекулах.

Помнится, в 80-х годах прошлого века у нас в городе не то чтобы популярно, а просто принято было, считалось хорошим тоном, особенно в рабоче-служащих кварталах, что на периферии, иметь на каждом балконе цветы. В кадках, горшках и горшочках, в длинных ящиках - цветниках, вьющиеся, гвоздики, герани, анютины глазки, чахлые и не слишком, согласитесь, кто застал то время, в этом было свое, пусть и немного мещанское, очарование.

Потом город стал меняться, повзрослел. На смену романтикам и провинциалам пришло наше прагматичное поколение, и цветочные клумбы постепенно забылись, лишь мертвыми букетами на цветочных базарах напоминая о попытке построить если не город-сад, то хотя бы город-цветник.

А вот европейцы, похоже, от такой мечты не откажутся ни за что. Они любят цветы. Они лелеют цветы. Они возвели цветоводство и цветочный дизайн в ранг искусства.

Петуния - один из любимцев европейских селекционеров, за века создавших потрясающее множество цветов, оттенков и форм этого непременного, а нередко основного жителя городских цветников. Современные селекционеры уже не полагаются только лишь на причуды природы, а самостоятельно и направленно изменяют живые организмы.

Задавшись целью получить сорт петуний, который обладал бы более яркими бардовыми лепестками, генетики ввели в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента. К удивлению ученых, многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и получались белыми.

С этого и других похожих наблюдений, сделанных в начале 90-х годов, и началась история малых РНК.

В другом эксперименте биологи, изучавшие генетическую регуляцию у одного из самых популярных в последнее время модельных организмов - червя Caenorhabditis elegans (Ценорабдитис элеганс , или сокращенно C. elegans ), пытались усилить работу определенных генов путем введения в клетки червя дополнительных копий таких генов (в виде ДНК). И снова, вместо усиления выраженности (экспрессии, о которой ниже) данного гена, ученые наблюдали противоположный эффект: его полное "замолкание".

Длительное время никто не мог объяснить происходившие феномены, рассматривая их как артефакты. И лишь спустя годы удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых "малых" РНК. К еще большему удивлению привело исследование структуры таких молекул. Оказалось, что эти РНК являются копией отдельных участков тех самых генов (ДНК), которые вводились в клетку, и активность которых подавлялась.

Снова - загадка. С одной стороны, структура таких малых РНК однозначно говорит о том, что они были скопированы с введенной в клетку ДНК, что для клетки вполне нормально (если не считать подозрительно малую длину этих молекул). С другой стороны - вместо того, чтобы, как большинство "нормальных" информационных РНК, переносить информацию для синтеза белков и способствовать, таким образом, усилению выраженности гена (например, усиливая цвет петуний), эти РНК каким - то образом умудряются проделывать совершенно противоположную работу.

Начиная с 1995 года, исследователи предприняли попытки повторить этот эффект экспериментально. Для этого они искусственно синтезировали небольшие участки РНК, являющиеся почти точной копией участка определенного гена, и вводили их различным организмам.

Первое подтверждение феномена "замолкания" генов было получено все у того же C. elegans. Немного позже это свойство коротких РНК выявили у мух и, наконец, в 2001 году - при введении в клетки мыши и человека. В том же 2001 году Science включил исследования малых РНК в число наиболее важных.

Почему же короткие РНК способны выполнять столь необычные функции?

Решение парадокса малых РНК началось с детального изучения их структуры, биологических характеристик и путей их превращения ( метаболизма ) в клетках различных организмов.

Длительное время биологи просто не обращали особого внимания на короткие отрезки клеточной рибонуклеиновой кислоты (РНК), полагая, что их роль в клетке не слишком значительна. Гораздо больший интерес привлекали другие типы РНК, а именно информационные и рибосомальные. Оба этих класса - очень длинные молекулы, содержащие до 100 000 нуклеотидов. Первые (информационные, которые часто называют также матричными РНК, или мРНК) переносят генетическую информацию с хромосом (ДНК) в специальные органеллы - "агрегаты" для синтеза белков - рибосомы. Второй класс - рибосомальная РНК - является одновременно и строительным материалом, и важнейшей рабочей частью рибосом.

Понятно, что с первого взгляда малые РНК, состоящие всего из нескольких десятков нуклеотидов, могли показаться просто мусором, остатками от своих "больших братьев". И даже несмотря на то, что роль отдельных малых молекул РНК в процессах превращения информационных РНК (сплайсинге), а также при упаковке нитей нуклеиновых кислот, была доказана ранее, истинным "хитом" в биологии малые РНК стали только лишь с открытием своей способности подавлять экспрессию генов у животных.

Характеристики

Список файлов учебной работы