Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан (1105578), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Распределение частиц по размерам в водном растворе лизоцима концентрацией 0,1 г/л.89Аналогичные эксперименты были выполнены для растворов смесей Lz –ПАВ. В таблице 4 приведены средние размеры частиц для растворов смесей Lz –DTAB и Lz – SDS. Установлено, что размер частиц практически не изменялся придобавлении DTAB, а также при добавлении SDS к раствору белка с концентрацией 0,1 г/л. Формирующиеся в растворах комплексы белок – ПАВ сохраняют компактную структуру. Следует отметить, что благодаря дисульфидным мостикаммолекула лизоцим весьма устойчива к различным воздействиям: даже подвергшейся тепловой денатурации Lz имеет размер глобулы не намного больший (гидродинамический радиус 22 Å), чем нативный белок (18 Å) [14].
Согласно литературным данным, комплекс SDS – Lz (SDS:Lz = 55÷100) также имеет компактныеразмеры (32 Å) [14, 15].При добавлении SDS к раствору белка концентрацией 1 г/л, начиная с концентрации SDS 5∙10-4 М, в растворе формируется осадок, препятствующий проведению измерений.Таблица 4.Диаметр частиц в растворах лизоцим – ПАВ.DTAB + LzSDS + LzCLz = 0,1 г/лCLz = 1 г/лCLz = 0,1 г/лCLz = 1 г/л03,5±0,52,5±0,33,5±0,52,3±0,310-44,0±2,02,3±0,36,0±2,05,6±3,010-32,4±0,82,4±0,22,7±0,6осадок10-22,7±0,72,6±0,53,6±0,9–C(ПАВ), MДля водных растворов смесей Lz (0,1 г/л) – CAPB получено, что в диапазонеконцентраций ПАВ 10-6 – 10-4 максимум распределения по размерам частиц соответствует значениям для глобулы Lz.
При концентрации 10-4 М и выше, в объемефазы присутствуют агрегаты, размеры которых составляют десятки и сотни нанометров (рис. 42). Отметим низкую воспроизводимость результатов, относящихсяк системам, в которых присутствуют крупные агрегаты.90Рис. 42. Распределение частиц по размерам в водных растворах смеси лизоцим – CAPB приконцентрации ПАВ 10-6 М (▬), 10-5 М (▬), 2·10-5 М (▬), 5·10-5 М (▬), 10-4 М (▬), 5·10-4 М (▬),10-3 М (▬).В водных растворах, находящихся в равновесии с октаном, появление крупных агрегатов в водной фазе происходит при более низких концентрациях CAPB(2·10-5М) (рис. 43а). Также как при мицеллообразовании в растворах индивидуального САРВ, присутствие второй органической фазы приводит к тому, что агрегаты Lz – САРВ в водном растворе, уравновешенным с октаном, возникают применьших концентрациях, чем в растворе, контактирующем с воздухом. В органической фазе при всех изученных концентрациях ПАВ присутствуют только малыечастицы, размер которых соответствует размеру глобулы Lz (рис.
43б).Крупные агрегаты в водном растворе могут быть образованы из частичноденатурированного белка, связанного с молекулами или мицеллами САРВ. Частичное разрушение нативной структуры лизоцима может быть вызвано как взаимодействием с цвиттерионной группой САРВ, способной нарушить систему водородных связей в белке, так и с наличием амидной группы САРВ, способной квзаимодействию с активным центром лизоцима. Как известно, ферментативноедействие лизоцима основано на разрушении амидных групп мурамилглюкозамина[214]. Кроме того, CAPB с лизоцимом может взаимодействовать и по механизмугидрофобного связывания (особенно длинноцепочечные компоненты CAPB).Крупные агрегаты начинают формироваться при той же концентрации CAPB, при91которой адсорбция ПАВ достигает постоянного значения, межфазное натяжениевыходит на плато, и начинается рост коэффициента распределения CAPB. Повидимому, в системе одновременно происходит несколько процессов: формирование гидрофобного комплекса Lz – CAPB, адсорбирующегося на межфазной поверхности, и образование гидрофильного комплекса в водном растворе.Рис.
43. Распределение частиц по размерам в водной (а) и органической (б) фазах системы Lz –САРВ при концентрации ПАВ 10-6 М (▬), 10-5 М (▬), 2·10-5 М (▬), 5·10-5 М (▬), 10-4 М (▬),5·10-4 М (▬), 10-3 М (▬).При концентрации белка 1 г/л крупные агрегаты образуются во всей области изученных концентраций добавленного САРВ.О формировании агрегатов в водных растворах смесей Lz – ПАВ можно судить на основании изучения светорассеяния. Для всех смесей Lz – ПАВ с концентрацией белка 1 г/л были получены спектры поглощения с максимумом при длиневолны 280 нм (рис.
44). Для смесей Lz – SDS при концентрации ПАВ 10-4 –925∙10-3 М в системе формируется осадок и на спектрах фиксируется высокое значение оптической плотности, выходящее за пределы рабочего диапазона измерений (OD выше 4). Эти спектры на рис. 44б не представлены.Рис. 44. Спектры поглощения растворов смесей Lz с DTAB (a), SDS (б), САРВ (в). Концентрация Lz 1 г/л, концентрация ПАВ 0 (▬), 10-6 М (▬), 10-5 М (▬), 5·10-5 М (▬),10-4 М (▬),5·10-4 М (▬), 10-3 М (▬), 5·10-3 М (▬), 10-2 М (▬).93Для растворов смесей были получены зависимости оптической плотностиот концентрации ПАВ при фиксированной длине волны 320 нм, соответствующейобласти рассеяния света (рис. 45).
Для смеси Lz – SDS была получена зависимость, проходящая через максимум в диапазоне концентраций ПАВ 10-4 – 5∙10-3 М(область формирования осадка). Для смеси Lz – CAPB характерен рост оптической плотности при увеличении концентрации ПАВ, что согласуется с увеличением размера частиц в водном растворе. В системе Lz – DTAB не происходит изменения оптической плотности.Рис. 45.
Зависимость оптической плотности растворов Lz – ПАВ при длине волны 320 нм отконцентрации SDS (а), CAPB (б, кривая 1) и DTAB (б, кривая 2).3.6. Изучение взаимодействия Lz – ПАВ методом флуоресценцииДля смесей лизоцим – ПАВ с концентрацией белка 1г/л были полученыспектры флуоресценции при возбуждении УФ светом с длиной волны 280 нм(рис. 46).94Рис. 46. Спектры флюоресценции лизоцима в присутствии DTAB (а), SDS (б) и CAPB (в) приконцентрации ПАВ 10-6 М (▬), 10-5 М (▬), 10-4 М (▬), 5·10-4 М (▬), 10-3 М (▬), 10-2 М (▬).Максимум флуоресценции во всех изученных системах наблюдается придлине волны 342 нм. Для индивидуального лизоцима интенсивность флюоресценции принимали за 100% и получили величины относительной флюоресценцииLz из смесей с ПАВ (рис. 46).
Для смеси Lz – SDS наблюдается рост интенсивности флуоресценции по сравнению с чистым Lz, начиная с концентрации ПАВ955·10-4 М. Подобный эффект наблюдается для смеси Lz – DTAB при более высокойконцентрации 10-2 М. Рост флюоресценции указывает на увеличение полярностимикроокружения триптофановых фрагментов лизоцима. Микрополярность можетувеличиваться при взаимодействии полярных групп ПАВ с белком, в результатечего формируется гидрофобный комплекс.Для смеси Lz – CAPB наблюдается тушение флуоресценции при добавленииПАВ. Максимальное снижение интенсивности флуоресценции происходит приконцентрации САРВ 10-4 М, когда в растворе появляются крупные агрегаты.
Тушение флуоресценции может быть вызвано уменьшением полярности микроокружения триптофана при взаимодействии с углеводородными цепями молекулПАВ.3.7. Ферментативная активность лизоцима в присутствии ПАВПри исследовании влияния ПАВ на ферментативную активность лизоцимапо отношению к клеткам M. luteus вначале было определено, как влияют ПАВ илизоцим по отдельности на фоновое изменение поглощения суспензии клеток вовремени AE = –dOD/dt. Установлено, что SDS и DTAB при концентрации менее10-4 М не влияют на величину AE (рис.
47 а,б). При более высоких концентрацияхПАВ происходило заметное изменение поглощения во времени, поэтому в дальнейшем проводили исследования в области концентраций этих ПАВ от 10 -7 до10-4 М. Добавки САРВ вплоть до концентрации 10-3 М практически не влияют напоглощение суспензии M. luteus (рис. 47в).96Рис. 47.
Зависимость оптической плотности суспензии клеток M.luteus от времени при добавлении DTAB (а), SDS (б) и CAPB (в) с концентрацией 10-6 М (♦), 10-5 М (Δ), 10-4 М (♦), 10-3 М (◊),10-2 М (▲).Зависимость ферментативной активности от концентрации лизоцима приведена на рис. 48. Нелинейный рост AE с увеличением концентрации лизоцима указывает на сложный механизм изучаемого процесса. Поэтому сопоставление активностей в присутствии и в отсутствие ПАВ позволяет сделать в основном качественные выводы о влиянии ПАВ на бактериолитическую активность лизоцима.97Рис. 48. Зависимость ферментативной активности от концентрации лизоцима.На рис.
49 представлены зависимости скорости бактериального лизиса клеток от концентрации SDS и DTAB, соответственно. Величины активности лизоцима без ПАВ, составляющие для растворов с концентрацией 0,01 и 0,1 г/л(3,8±0,6)∙10-4 с-1 и (1,24±0,25)∙10-3 с-1 , соответственно, отмечены на рисункахпунктирными линиями.
Как видно из графика, при концентрации лизоцима 0,01г/л добавки как анионного, так и катионного ПАВ в области малых концентрацийприводят к росту скорости лизиса. Затем, при дальнейшем увеличении концентрации SDS свыше 5∙10-5 М, а DTAB более 3∙10-6 М, активность снижается до величины, близкой к активности лизоцима в отсутствие ПАВ. При концентрациилизоцима 0,1 г/л оба ПАВ слабо влияют на скорость лизиса.Для смесей Lz с DTAB и SDS увеличение ферментативной активности Lzпроисходит в диапазоне концентраций 10-7 – 4∙10-6 М, при которой формируетсягидрофобный комплекс (рис.
49). Можно предположить, что в результате взаимодействия с ПАВ меняется микроокружение активного центра лизоцима, чтоприводит к уменьшению электростатического отталкивания между ферментом иклеткой. Активность снижается в области концентраций ПАВ, при которой начинают формироваться гидрофильные комплексы. Однако, следует отметить, чтоденатурации белка в присутствии DTAB и SDS не происходит: активность снижается до значений, характерных для индивидуального лизоцима.98Рис. 49. Изменение ферментативной активности лизоцима с ростом концентрации ПАВ DTAB(а) и SDS (б).
Концентрация лизоцима 0,01 г/л (◊) и 0,1 г/л (♦). Пунктирные линии – ферментативнаяактивность Lz в отсутствие ПАВ. Сплошные линии – расчет по уравнению 3-9.Для описания экспериментальных данных рассмотрим простую модель, согласно которой на белке есть два типа участков связывания, которые можно охарактеризовать константами десорбции Кд1 и Кд2 для данного ПАВ. Эти участкисвязывания соответствуют формированию гидрофобного и гидрофильного комплексов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
