Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан (1105578), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В результате лизиса клеток фиксировали уменьшение оптической плотности суспензии. В качестве характеристики активности определялиизменения поглощения на начальном участке AE =. Скоростьуменьшения поглощения на начальном линейном участке пропорциональна изменению числа «целых» клеток и служит надежной характеристикой бактериолитического действия фермента [206]. Поскольку во всех экспериментах величина OD56линейно уменьшалась в интервале времени от 5 до 20 с от начала лизиса, ферментативную активность оценивали как –dOD/dt на начальном линейном участке(пунктирная линия на рис. 12). В отсутствие бактериолитических факторов фонового самопроизвольного лизиса клеток в условиях эксперимента не наблюдалось.Суспензию клеток использовали в течение двух часов после ее приготовления.Рис.
12. Изменение оптической плотности суспензии M.luteus после добавления лизоцима.2.2.7. Избирательное смачиваниеДля исследования стабилизирующего действия смесей Lz – ПАВ было изучено их влияние на устойчивость смачивающих пленок и на кинетику растеканиякапель при избирательном смачивании. Изучение избирательного смачивания всистеме водный раствор смеси Lz – ПАВ/октан/гидрофобизованное стекло проводили следующим образом. Пластину предметного стекла размером 1×2 см очищали в хромовой смеси, трижды промывали водой и высушивали на воздухе.
Затемпроводили гидрофобизацию в парах диметилдихлорсилана в течение суток с последующей промывкой хлороформом. Краевой угол воды на модифицированнойповерхности составлял 103±2 град. Пластину помещали в кювету, заполненнуюводным раствором, в специальный держатель и снизу подводили каплю октана спомощью шприца с загнутой иглой (рис. 13а).57Рис.
13. Схема эксперимента по изучению избирательного смачивания (а) и видеоизображениекапли октана, соприкасающейся с поверхностью стекла в среде водного раствора смеси Lz –ПАВ (б, в). (б) – капля в начальный момент времени, (в) – капля после растекания.После прорыва смачивающей пленки капля октана смачивала поверхностьгидрофобизованного стекла. Процесс избирательного смачивания изучали с помощью профильной (боковой) видеосъемки с использованием высокоскоростнойвидеокамеры Fastvideo-400 (НПО «Астек», Россия), скорость съемки до 1000кадр/с (рис.
13 б, в). Каждый эксперимент повторяли 3 раза.Анализ полученных видеофайлов позволил определить время прорыва смачивающей пленки и изучить кинетику растекания капель. Для этого был проведенпокадровый обмер радиуса смоченной площади R и краевого угла θ в зависимостиот времени t. Для удобства проведения дальнейших расчетов краевой угол отсчитывали в сторону капли октана.58III.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.3.1. Взаимное влияние лизоцима и ПАВ на распределение в системе вода/октанМетодом сцинтиллирующей фазы были определены концентрации компонентов смесей в октане и по уравнению (2-5) рассчитаны коэффициенты распределения меченого лизоцима и ПАВ в системе вода/октан.Для индивидуального лизоцима коэффициент распределения составляет(3,3±0,2)∙10-4 во всем диапазоне изученных концентраций белка.
РаспределениеDTAB постоянно во всем диапазоне концентраций, D = (6,0±0,5)∙10-4. Коэффициент распределения индивидуального SDS составляет (4,3±1,3)∙10-3.Коэффициент распределения лизоцима в бинарных растворах, содержащих0,01 г/л белка и 10-7 – 10-6 М ПАВ, составляет (4,5±0,4)·10-4 в случае смеси сDTAB и (5,2±0,5)·10-4 для смеси с SDS (рис. 14). Эти значения выше, чем D индивидуального лизоцима на 40% и 60% для смеси с DTAB и SDS, соответственно.При концентрации ПАВ 10-6 М, что соответствует мольному соотношениюLz:ПАВ в системе ≈1:1, коэффициент распределения лизоцима снижается до значений (3,3±0,6)∙10-4, что совпадает с величиной D для индивидуального лизоцима.При концентрации DTAB и SDS 10-6 М мольное соотношение Lz:ПАВ в органической фазе составляет ≈1:3 и ≈1:2, соответственно.
С ростом концентрации ПАВдальнейшего изменения величины D не происходит. Коэффициент распределениябелка из смеси с концентрацией 0,1 г/л больше D индивидуального белка на 40%(DTAB) и 80% (SDS) в области концентраций ПАВ 10-7 – 10-4 М. При мольном соотношении Lz:ПАВ в системе свыше 1:10 происходит снижение D до значенийблизких коэффициенту распределения индивидуального лизоцима.59Рис. 14. Коэффициенты распределения лизоцима в смесях с DTAB (а, в) и SDS (б, г).
Концентрация белка 0,01 г/л (а, б) и 0,1 г/л (в, г). Пунктирные линии – коэффициент распределения индивидуального Lz.В присутствии лизоцима концентрация DTAB в органической фазе заметновыше, чем в случае индивидуального ПАВ для разбавленных растворов (концентрация ниже 5∙10-6 М) (рис. 15 а). Дальнейший рост концентрации DTAB приводит к снижению D до 6∙10-4, что соответствует величине D для индивидуальногоDTAB. Добавление лизоцима (с = 0,01 мг/мл) повышает D SDS в области малыхконцентраций добавленного ПАВ (ниже 10-6 М) и практически не влияет на DSDS при более высоких концентрациях ПАВ (рис. 15 б).При концентрации белка 0,1 г/л коэффициент распределения DTAB совпадает со значением для индивидуального ПАВ, а коэффициент распределения SDSуменьшается.60Рис. 15.
Зависимости концентрации DTAB (а) и SDS (б) в органической фазе от их концентрации в водной фазе для индивидуальных ПАВ (♦) и ПАВ в присутствии лизоцима концентрацией0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (▲).Рост коэффициентов распределения лизоцима в бинарных растворах можетбыть связан с формированием гидрофобных комплексов белок ‒ ПАВ, обладающих большей растворимостью в органической фазе, чем нативный белок.Добавки CAPB практически не влияют на распределение лизоцима (рис. 16)61Рис.
16. Зависимость коэффициента распределения лизоцима в системе вода/октан от концентрации CAPB при концентрации белка 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (▲). Пунктирные линии – коэффициент распределения индивидуального Lz.Коэффициент распределения САРВ в области малых концентраций(до 10-5 М) постоянен и составляет (1,1±0,3)∙10-3, при дальнейшем увеличенииконцентрации CAPB происходит рост значений D (рис. 17). В присутствии Lz величины D САРВ увеличиваются примерно в два раза. Величины D САРВ в смешанных растворах также постоянны вплоть до концентрации 5∙10-5 М, а затем начинают возрастать.Рис. 17. Зависимость коэффициента распределения CAPB в системе вода/октан от концентрации ПАВ для индивидуального CAPB (♦) и для CAPB в присутствии Lz 0,01 г/л (♦) и0,1 г/л (▲).62Рост D как в растворе индивидуального CAPB, так и в его смеси с лизоцимом может быть связан с образованием обратных предмицеллярных агрегатов вобъеме органической фазы.
Молекулы САРВ, благодаря наличию положительныхи отрицательных зарядов в цвиттерионной полярной группе, могут взаимодействовать друг с другом за счет электростатического притяжения, образуя димеры,тримеры и т.д. Образованные агрегаты оказываются более гидрофобными и, соответственно, более растворимыми в октане, чем исходные молекулы CAPB.
Дляобоснования предположения о формировании в органической фазе обратных мицеллярных агрегатов, были проведены эксперименты по изучению распределенияводы в системе, содержащей САРВ. Полагали, что при образовании обратных мицелл увеличится растворимость воды в органической фазе. Исследование проводили методом сцинтиллирующей фазы с использованием меченной тритием воды.Таблица 1.Объемная доля воды в октане в системе водный раствор/октан.Состав водной фазыОбъемная доля воды в октанеH2O(4,3±1,2)∙10-5-3-5+ CAPB (10 М)+ Lz (0,1 г/л)(4,8±1,2)∙10+ Lz – CAPB(3,7±0,5)∙10-5(3,9±0,8)∙10-5По литературным данным, растворимость воды в октане составляет 6,1∙10-5мл/мл [209], что согласуется с полученным нами значением (таблица 1). Установлено, что в системах, содержащих CAPB, Lz и смесь Lz – CAPB, растворимостьводы практически не меняется.
Это означает, что заметной полярной области(ядра обратных мицелл) в данных условиях не образуется, однако полученный результат не противоречит предположению о формировании в октане агрегатов сменьшим числом агрегации (например, димеров САРВ).633.2. Адсорбция смесей лизоцим – ПАВ на границе вода/октанАдсорбция лизоцима из индивидуальных растворов с концентрацией белка0,01 и 0,1 г/л, рассчитанная по данным метода сцинтиллирующей фазы с помощью формулы (2-6), составила 8,2∙10-9 моль/м2 и 2,0∙10-8 моль/м2, соответственно.Ранее было установлено, что при формировании на границе вода/октан насыщенного слоя из глобул Lz, ориентированных главной осью параллельно поверхности, адсорбция Lz составляет 4·10-8 моль/м2, а из ориентированных перпендикулярно поверхности – 1,3·10-7 моль/м2 [4, 65]. Таким образом, в нашем эксперименте молекулами Lz занята примерно четверть (при концентрации 0,01 г/л) или половина (при 0,1 г/л) поверхности.При добавлении DTAB к раствору белка с концентрацией 0,01г/л в областималых концентраций ПАВ 10-7 – 10-6 М адсорбция лизоцима в 2,5 раза выше, чему индивидуального белка, и составляет ≈2·10-8моль/м2 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
