Диссертация (1102418), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Влияние HTLP на продукцию TNF-α клеточной линииRAW 264.7 с инактивированными генами целевых рецепторов CR3, Dectin-1и TLR-6 после 24-ех часовой инкубации.TNF-αГруппавкультуральнойжидкости (М±SD), пкг/мл1Контроль – физиологический раствор18,02 ± 7,562Дектин-1 (физиологический раствор)21,00 ± 8,003CR3 (физиологический раствор)15,88 ± 6,604TLR-6 (физиологический раствор)13,65 ± 6,565LPS (физиологический раствор)131,85 ± 13,20*6LPS - Дектин-1 (физиологический раствор)120,78 ± 12,06*7LPS - CR3 (физиологический раствор)123,08 ± 10,89*8LPS – TLR-6 (физиологический раствор)129,82 ± 12,60*9Опыт (HTLP, 100 мкл/мл)133,80 ± 13,80*10 Дектин-1 (HTLP, 100 мкл/мл)26,70 ± 7,6011 CR3 (HTLP, 100 мкл/мл)124,32 ± 12,60*12 TLR-6 (HTLP, 100 мкл/мл)28,73 ± 9,63*-достоверное различие с контролем (критерий Манна-Уитни) (p<0,05).Данные по влиянию LPS на выработку TNF-α в культуре клетокдемонстрируют взаимосвязь между основным – TLR-4 рецептором LPS ирецепторами CR3, TLR-6 и Dectin-1.
Выключение этих рецепторов приводитк сдвигу равновесия во внутриклеточной системе передачи сигнала иуменьшает продукцию цитокина к 4-му часу.11512010080Физ.раствор60LPSHTLP40200Без выключенияCR-3TLR-6Dectin-1Рисунок 19. Диаграмма сравнений уровней выработки TNF-α клеточнойлинии RAW 264.7 с инактивированными генами целевых рецепторов CR3,Dectin-1 и TLR-6 через 4 часа инкубации.160,00140,00120,00100,00Физ.раствор80,00LPSHTLP60,0040,0020,000,00Без выключенияCR-3TLR-6Dectin-1Рисунок 20. Диаграмма сравнений уровней выработки TNF-α клеточнойлинии RAW 264.7 с инактивированными генами целевых рецепторов CR3,Dectin-1 и TLR-6 через 24 часа инкубации.1163.3.7. Блокирование рецепторов антителами и продукция TNF-αВтораяэкспериментальнаямодель,вкоторойпроверялсямолекулярный механизм действия HTLP – инактивация целевых рецепторовTLR-6, CR3 и Dectin-1 высокоспецифичными моноклональными антителами.Были получены данные, приведенные в таблице 18 и на рисунке 21.Таблица 18.
Влияние HTLP на продукцию TNF-α после 4-ех часовинкубации при антительном блокировании рецепторов.TNF-α в культуральнойГруппа№жидкости (М±SD), пкг/мл1Контроль – физиологический раствор6,47 ± 1,162Дектин-1 (физиологический раствор)8,32 ± 1,213CR3 (физиологический раствор)4,88 ± 1,074TLR-6 (физиологический раствор)7,25 ± 2,235LPS (физиологический раствор)6LPS – Дектин-1 (физиологический раствор)72,10 ± 7,19*7LPS – CR3 (физиологический раствор)77,36 ± 6,31*8LPS – TLR-6 (физиологический раствор)76,51 ± 8,01*9Опыт (HTLP, 100 мкг/мл)90,52 ± 8,69*10 Дектин-1 (HTLP, 100 мкг/мл)7,13 ± 3,74101,81 ± 11,32*11 CR3 (HTLP, 100 мкг/мл)84,73 ± 7,91*12 TLR-6 (HTLP, 100 мкг/мл)9,22 ± 3,22*-достоверное различие с Контролем (критерий Манна-Уитни) (p<0,05).Так же, как и в модели выключения генов, полученные данные,демонстрируют, что HTLP стимулирует выработку TNF-α, при этом уровень117стимуляциисравнимслипополисахаридом,которыйявляетсяярковыраженным стимулятором выработки фактора некроза опухолей.
Более тогобыло подтверждено участие двух рецепторов в активации клеток припомощи HTLP – Dectin-1 и TLR-6 [273].120,00100,0080,00Физ. раствор60,00LPSHTLP40,0020,000,00Без обработкиантителамиCR3TLR-6Dectin-1Рисунок 21. Диаграмма сравнений уровней выработки TNF-α клеточнойлинии RAW 264.7 после инактивации моноклональными антителами целевыхрецепторов TLR-6, CR3 и Dectin-1 через 4 часа инкубации.3.3.8. Индукция интерферона in vivo и in vitroКак и следовало ожидать, в надосадочных жидкостях контрольныхкультурбылавыявленаинтерферониндуцирующаяактивность.Максимальный титр IFN для ВБН составлял 536,2 МЕ/мл, тогда как для СЭА,индуктора IFN-, он был значительно ниже – 62,3 МЕ/мл.
Вероятно, этосвязано с тем обстоятельством, что биосинтез IFN- обычно возрастает к 72ум часам и в более поздние сроки культивирования клеток выходит на плато118[274]. Для госсипола этот показатель был равен 7,8 МЕ/мл при концентрацииего в культуральной среде 10 мкг/мл и 9,3 МЕ/мл при 50 мкг/мл. Возможно,такая низкая интерферониндуцирующая активность объясняется его высокойтоксичностью не только для фибробластов человека, но и для клеток крови.В отличие от госсипола и СЭА полисахарид из Helianthus tuberosus L. в обеихдозах через 24 часа индуцировал интерферонподобную активность,обладающую высоким интерферониндуцирующим эффектом. Так, приконцентрации полисахарида 10 мкг/мл в ростовой среде активностьиндуцируемого им IFN составляла 184,4 МЕ/мл.
В этом случае антивируснаяактивность IFN была несколько ниже, чем при использовании ВБН,классического индуктора IFN-, вызывающего через 24 часа максимальныйвыброс IFN клетками в культуральную среду. На основе представленныхданных можно заключить, что растительный полисахарид является сильныминдуктором IFN, что убедительно подтвердилось в опытах на мышах in vivo.Интерферониндуцирующую активность природного углевода и госсиполапроверяли после внутрибрюшинного введения мышам препаратов в дозе 25мкг.
Максимальная продукция сывороточного IFN через 6 ч. после введенияраствораполисахаридадостигала256МЕ/мл,тогдакакгоссиполиндуцировал 8–16 МЕ/мл IFN. Таким образом, титры IFN, синтезированногоу мышей в ответ на введение полисахарида, в 16–32 раза превышали уровеньIFN в ответ на госсипол.Полисахарид во всех разведениях индуцировал высокий уровень IFN.При этом титры синтезированного им IFN приближались к показателям,продуцируемого клетками крови IFN под воздействием такого мощногоиндуктора,какВБН,значительнопревышаяпоказателиинтерферонообразования под воздействием аналогичных концентрацийгоссипола, а также индуктора IFN- СЭА.
Учитывая тот факт, что углеводпроявил более выраженную интерферониндуцирующую активность, чемСЭА и госсипол, можно предположить, что он является индукторомсмешанного типа IFN-, - и -.119Таким образом, природный полисахарид является достаточно сильныминдуктором IFN, не токсичным, в отличие от госсипола и СЭА, и какбудущее лекарственное средство более пригодным для человека и животных,чем индукторы IFN вирусной природы.3.3.9. Стимуляция активности натуральных киллеровАктивность NK представлена в таблице 19: у пяти пациентов безинкубации и с инкубацией с углеводом.
Индекс цитотоксичности (CI)определяли по формуле: CI = (1-А/Б)×100%, где А- число импульсов в тестячейках; Б- число импульсов в контрольных ячейках.Таблица 19. Влияние полисахарида HTLP на активность NK in vitro.ОбразецВключение 3H-уридина, импульс/минM±mK562365434153473298729733300K562 + HTLP278432902893358931303173K562 + ЛПК132511691298104715831284K562 + ЛПК +HTLP687756834739697743Индекс цитотоксичности составил для модели с добавлением ЛПК – 61± 3, при добавлении ЛПК совместно с полисахаридом – 78 ± 3. При этомдобавление только полисахарида не приводило к сильной цитотоксичности ииндекс составил 4 ± 1. Из полученных данных видно, что полисахаридусиливает активность натуральных киллеров in vitro, но при этом не являетсяцитотоксическим агентом.3.3.10.РезультатыПротивовирусная активностьпримененияраствораполисахаридагерпетического менингоэнцефалита приведены в таблице 20.120намоделиТаблица20.Результатыпроверкипротивовируснойактивностиполисахарида HTLP.СхемаВыживаемость, Летальность, Защитныйприменения%СПЖ, суткиэффект, %%препаратаДоза вируса – 10ЛД50HTLP За 580206313,3 ± 1,970305311,9 ± 1,6Ацикловир3268157,81 ± 1,9Контроль1783-4,1 ± 1,25743579,8 ± 2,963376310,5 ± 1,8Ацикловир010005,3 ± 1,8Контроль0100-3,3 ± 1,2днейHTLP За 5дней и через3 часаДоза вируса – 100ЛД50HTLP За 5днейHTLP За 5дней и через3 часаИз таблицы 20 следует, что полисахарид обладает ярко выраженнымпротективным и терапевтическим действием.
Выживаемость составила 80%и 70% при введении HTLP за 5 дней и за 5 дней и через 3 часа послеинфицирования 10ЛД50, а при 100ЛД50 – 57% и 63%, соответственно. Приэтом в контроле выживаемость составила 17%, что меньше в 3,4 и 3,7 раза,чем в опытных группах. При дозе вируса 10ЛД50 защитный эффект колебалсяв интервале 53–63% в сравнении с ацикловиром – 15%; а при дозе 100ЛД50 –57–63% при отсутствии эффекта у ацикловира вообще и полном вымирании121контроля.
Вместе с тем средняя продолжительность жизни выросла вопытных группах с HTLP в 3,2 и 2,9 раза, а у Ацикловира только в 1,9 при10ЛД50, а при 100ЛД50 с HTLP – в 3,0 и 3,2 раза, а Ацикловира – 1,6.Данные свидетельствуют о противовирусной активности HTLP.В3.3.11.Противоопухолевая активность HTLP3.3.11.1.Противоопухолевая активность in vitroтаблице21представленыданныеиллюстрирующиепротивоопухолевую активность HTLP в дозах 100 и 200 мкг/мл на клеточныхлиниях Hep-2 и L-929, которая ведет к деструкции трансформированныхклеток.Таблица 21. Ингибирование in vitro опухолевого роста клеточныхлиний Hep-2 и L-929 полисахаридом HTLP.КлеткиЧислоклетокДозаполисахаридамкг/млЧисло клетокчерез 24 часа(M ± m)Ингибирование,%Контроль10×104-20×104 ± 1,9-Hep-210×10410018×104 ± 1,210Hep-210×10420010×104 ± 0,340Контроль10×104-16×104 ± 1,2-L-92910×10410010×104 ± 1,237.5L-92910×1042003×104 ± 0,481.2Полученные результаты демонстрируют торможение роста опухолевыхклеточных линий.
При этом максимальное значение достигалось при 200мкг/мл – 81,2% для L-929 и 40% - Hep-2.Такое торможение роста культуры клеток, скорее всего, связано сзапуском проапоптотических каскадов в трансформированных клетках,поскольку HTLP не обладает прямым цитотоксическим действием, что былопоказано в одном из экспериментов.1223.3.11.2.Антиметастатическая активность HTLP в моделикарциносаркомы Уокера in vivoТаблицы 22 и 23 демонстрируют, что полисахаридная субстанцияпроявляетантиметастатическуюактивностьвширокомдиапазонеконцентраций: и в 1,5 мкг на животное, и в 100 мкг. Учитывая курсовое идозовоеразличие,атакжевременнуюразницувпроявленииантиметастатических и противоопухолевых свойств, можно утверждать, чтоосновой биологической активности является непрямое воздействие наопухолевые клетки. Однако нельзя отрицать и наличие прямого воздействия.Такоедействиевозможновслучаеактивацииапоптозавтрансформированных клетках. Учитывая наличие иммуномодулирующейактивности у полисахарида из Helianthus tuberosus L., можно утверждать, чтополисахарид обладает прямым и непрямым противоопухолевым действием.Таблица 22.
Уменьшение числа клонов при ежедневном введении0,015 мг/кг полисахарида HTLP в модели карциносаркомы Уокера in vivo.Число клоновКонтроль,М±мОпыт,М±мДень забояживотныхИнгибированиеметастазов (% отконтроля)22,8 ± 3,916,2 ± 3.7528,979,0 ±11,749,7 ± 9,681037,1Таблица 23. Уменьшение числа клонов при ежедневном введении 1,0мг/кг полисахарида в модели карциносаркомы Уокера in vivo.Число клоновКонтрольМ±мОпытМ±мДень забояживотныхИнгибированиеметастазов (% отконтроля)22,8 ± 3,916,8 ± 2,95526,379,0 ± 11,749,6 ± 9,681037,21233.3.11.3.In vivo противоопухолевая и антиметастатическая активность вмодели карциномы легких ЛьюисаВлияние HTLP на вес первичной опухоли показан в таблице 24.Параметром торможения роста опухоли являлась разница между кинетикойроста опухоли в контрольной и опытной группе. Коэффициент торможенияроста опухоли (КТР, %) определялся следующим образом: TGI = 1 – PT/PC,где P – вес опухоли в C – контроле и T – опытной группе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
