Диссертация (1102418), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Растворполисахарида (0,1 мг/мл) вводили в хвостовую вену за пять суток доинфицирования, а также за пять суток до и через 3 ч после инфицирования.Ацикловир вводили по лечебной схеме через 3, 24, 48, 72 и 96 ч послезаражения. Мышам контрольной группы вводили физиологический раствор.Результаты оценивали по средней продолжительности жизни изащитному эффекту – разнице показателей выживаемости в опытной иконтрольной группе.2.2.7.11.Противоопухолевая активность2.2.7.11.1. Изучение противоопухолевой активности HTLP in vitroДля изучения противораковой активности in vitro использовали линииклеток Hep-2 – карциносаркома гортани человека и L-929 – мышиная81анеуплоиднаяфибросаркома.Культивированиепроводиливмодифицированной среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки исмеси антибиотиков – пенициллина и стрептомицина в концентрации 100ед/мл при 37 °С с содержанием 5% СО2 в условиях 95% влажности, в течение24 часов.В клеточные линии добавляли раствор полисахарида в полной средеNaCl в концентрациях 0,1 и 0,2 мг/мл.
Оценка противораковой активностивелась подсчетом видимых раковых клеток с использованием микроскопа,окрашенных трипановым синим, сравнительно с контрольными культурами.Производился подсчет процента ингибирования роста раковых клеток.2.2.7.11.2. In vivo антиметастатическая активность в моделикарциносаркомы УокераИсследованиеinvivoактивностипротивораковыхсвойствполисахарида из Helianthus tuberosus L. и изучение воздействия углеводноймолекулынаметастазыпроводилинаперевиваемойопухолисизбирательной органотропностью и повышенной клоногенностью в условияхinvivo–высокоаффинномштаммекарциносаркомыУокера.Карциносаркому вводили в хвостовую вену самцам и самкам крыс породы«Август», которая формировала опухолевые узлы в легких.
Контрольные иэкспериментальные группы состояли из 20 мышей.Полисахаридный раствор вводился подкожно в дозах 0,015 и 1,0 мг/кг(100 мкг на крысу) ежедневно в различном режиме. Клоны были вылущеныиз легких после декапитации крыс. Были сформированы следующие группы:1. Контрольная – введение раствора 0,2 мл хвостовую вену 0,9% NaCl.Забой производился на 5-ые сутки после перевивки.2. Контрольная – введение раствора 0,2 мл хвостовую вену 0,9% NaCl.Забой производился на 10-ые сутки после перевивки.3.
Ежедневное введение 0,015 мг/кг полисахарида через 3 послеперевивки. Забой производился на 5-ые сутки после перевивки.824. Ежедневное введение 0,015 мг/кг полисахарида через 3 послеперевивки. Забой производился на 10-ые сутки после перевивки.5. Ежедневное введение 1,0 мг/кг полисахарида через 3 послеперевивки. Забой производился на 5-ые сутки после перевивки.6.
Ежедневное введение 1,0 мг/кг полисахарида через 3 послеперевивки. Забой производился на 5-ые сутки после перевивки.2.2.7.11.3. In vivo противоопухолевая и антиметастатическая активностьполисахарида в карциноме легких ЛьюисаАнтиметастатическую активность HTLP изучали на модели карциномылегких Льюиса. Клетки карциномы легких Льюиса получали от ранееперевитых мышей, измельчая ткань опухоли в растворе Хенкса.
0,3 млклеточной суспензии, содержащей 2×106 опухолевых клеток, перевивалимышам линии C57BL/6 внутримышечно в бедренную часть задней лапы.Раствор HTLP в дозах 0,5 и 5 мг/кг веса мыши в 0,9% NaCl вводилиподкожно на 4 день после перевивки. Для исследования были выбраны двакурса – однократное и пятикратное введение.
В период развития опухоли умыши, вес первичной опухоли замеряли 5 раз на 5-ый, 11-ый, 14-ый, 17-ый и20-ый день после перевивки, как разница между весом ноги с опухолью ибез. Легкие взвешивали и подсчитывали число колоний онкологическихклеток в легких, которые были фиксированы в растворе Боуэна (Penta, 1102011000). Мышей забивали путем декапитации и опухолевые образцыподвергалисьгистологическомуисследованию.Дляустановленияантиметастатической активности HTLP число метастазов подсчитывалинапрямую. Контрольные и экспериментальные группы состояли из 20мышей.2.2.7.12.РадиопротекцияДля оценки радиопротекторной активности HTLP использовали двемодели: абсолютной выживаемости и выживаемости гемопоэтических83стволовых клеток. Животные находились в условиях содержания и питаниялабораторного вивария.2.2.7.12.1.
Экспериментальная модель абсолютной выживаемостиОпыты проводили на мышах-самцах линии BALB/c массой 20–25 г.Соединение вводили внутривенно за 1 час до лучевого воздействия и через 1,6 и 24 часа соответственно, в дозах 1, 10 и 100 мкг/животное. Лабораторныеживотные подвергали лучевому воздействию разной степени: 800 и 850 рад.Облучение проводили на установках «ИГУР» (137Cs, мощность дозы 158рад/мин в течение 5 мин 04 с). Для облучения мышей помещали по 10 особейв пластиковые пеналы.
Животных опытных и контрольных групп облучалиодновременно, после чего содержали в одних и тех же условиях.Противолучевая активность изучалась в условиях двукратного повторенияопытов. Контролем служили только облученные животные. В течение 30суток за состоянием подопытных мышей наблюдали, регистрировалиповедение, состояние шерстяного покрова и кожи, потребление корма ипищеварение.2.2.7.12.2. Экспериментальная модель выживаемости гемопоэтическихстволовых клетокОпыты проводили на самцах мышей линии F1(CBA×C57B1/6) массой20–27 г.
Соединение вводили внутривенно за 1 и 3 часа до и через 1 и 24 часапосле облучения соответственно, в дозе 10 мкг/животное. Лабораторныеживотные, 5 групп по 12 животных, подвергались воздействию гаммаизлучения (60Co) в дозе 600 рад на аппарате «Луч» (52,63 рад/мин в течение11 мин 24 с). Контрольной группой служили только облученные животные.Через 8 суток проводилась эвтаназия мышей путем введения растворанембутала в расчете 60 мг/кг внутривенно. После чего, производилосьизвлечение селезенки, которую взвешивали и помещали для фиксации всвежеприготовленный раствор уксусного спирта (3 части 95% этиловогоспирта и 1 части ледяной уксусной кислоты).
Фиксация селезенки длилась 284часа, после чего орган переносили в 70% раствор этилового спирта, ипроизводилсяподсчетобразовавшихсяселезеночныхколонийнаповерхности селезенок, диаметром более 0,2 мм. Вычислялось среднее числосформированных колоний и стандартная ошибка.2.2.8. Биофизическое моделирование бифуркацииВ модели рассматриваются клетки, имеющие на поверхности своейклеточной мембраны рецепторы Dectin-1, димер TLR-6/TLR-2 и TNFR1.Была выдвинута гипотеза о возможности формирования бифуркационногосостояния в клеточных системах за счет взаимодействия полисахаридноймолекулы с вышеупомянутыми рецепторами.Принципиальная схема модели передачи внутриклеточного сигналапри связывании полисахарида с рецепторами и формированием петлиобратной связи с участием TNF и TNFR1 представлена на рисунке 7.Рисунок 7. Принципиальная схема формирования регуляторных сигналов вклетке при взаимодействии HTLP с рецепторами Dectin-1 и TLR-6.
Геномизображен в виде двойной спирали ДНК. Сигнал через NF-κB приводит кактивации c-FLIP, увеличению экспрессии TNF и TNFR1. Образование85тримера (TNF–TNFR1)3 приводит к усилению экспрессии как TNF, так иTNFR1. [244]На наружной стороне мембраны HTLP связывается с рецептором Dectin1 (или TLR-6), а затем с TLR-6 (или Dectin-1). Взаимодействие HTLP сDectin-1 приводит к димеризации рецептора. Связывание с рецепторамиDectin-1 и TLR-6 приводит к синтезу цитокина TNF (предположительно попути через NF-κB) и активации внутриклеточного белкового комплексаTRADD/FADD рецептора TNFR1 через адапторный белок MyD88.
Последняястадия ингибируется при связывании белка SODD с цитоплазматическим«доменом смерти» – DD. SODD постоянно присутствует в цитоплазме ипрепятствует переходу клетки на путь апоптоза через TRADD, причем циклсвязывания–диссоциации SODD с DD имеет длительность около 10 минут.Вместе с тем, по пути через NF-κB передается и противоапоптотическийсигнал, увеличивающий наработку в клетке TNF, TNFR1 и второгоингибитора апоптоза – c-FLIP белка, который, взаимодействуя с каспазойcaspase8, ингибирует формирование апоптотического каспазного комплекса.Этот фактор активируется опосредованно, с участием NF-κB пути.Вновь синтезированные TNF и TNFR1 способны образовыватькомплексы, которые взаимодействуют и образуют тримеры (TNF–TNFR1)3,что приводит к генерации внутриклеточного сигнала к увеличениюэкспрессии как TNF, так и TNFR1 [245].
Таким образом формируется петляположительной обратной связи, усиливающая проапоптотический сигнал врезультате образования все большего числа активных TRADD и FADDбелков путем автофосфорилирования. После достижения порогового уровняэтого сигнала клетка может перейти из проапоптотического состояния кпредапоптотическому и апоптозу.Известных экспериментальных данных недостаточно для определениявсех параметров полной кинетической модели, соответствующей схеме,приведенной на рисунке 7. Этим обусловлена необходимость дальнейшегоупрощения модели с сохранением физической сути процессов регуляции86переключений между различными формами реакции клетки на присутствиеHTLP во внеклеточной среде.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
