Диссертация (1102418), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Затем добавляют комплемент в объеме 3 мл (чтобы покрытьагарозу) в рабочем разведении и инкубируют 1 час. Проверяют отсутствиеобщего лизиса. Подсчитывают зоны лизиса в одной чашке и пересчитываютколичество АОК на селезенку. Одна зона лизиса соответствует одной АОК.Определяют Кст, где Кст – отношение количества АОК в опыте к количествуАОК в контроле.2.2.7.3.Культивирование клеток RAW 264.7Все работы с культурой клеток проводят в стерильном ламинарномбоксе.Культивирование мышиной макрофагальной культуры RAW 264.7проводят в среде DMEM (Sigma-Aldrich, 6D546) с добавлением 2 мМ Lглутамина (Sigma-Aldrich, G7513), 10% FBS (Sigma-Aldrich, F2442) отобъема и смеси антибиотиков пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина(100 мкг/мл) (ПанЭко, А065).Клетки инкубируют в термостате при 37 °С во влажной атмосфере,содержащей 5% углекислого газа.
Клетки культивировали в пластиковыхкультуральных флаконах (Corning, CLS431080) с добавление 35 мл полнойсреды. Пересев клеток проводят при 70–80% конфлюэнтности через 2–370дня. Снятие клеток с подложки производится механически или сиспользованием трипсина, в зависимости от целей эксперимента.Клеткибылилюбезнопредоставленылабораториейпередачивнутриклеточных сигналов в норме и патологии ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН, д.б.н. Купрашом Д.В.2.2.7.4.Оценка цитотоксичности HTLP на клетки линии RAW 264.7Оценку жизнеспособности клеток проводят через 24 часа последобавления 200 мкг/мл раствора HTLP путем окрашивания культур клетокпропидий иодидом (Sigma-Aldrich, 81845) и бис-бензимидом (Sigma-Aldrich,14530) с целью обнаружения ядер погибших клеток и общего количестваклеток в культуре соответственно.
Визуализацию окрашивания проводят спомощью инвертированного микроскопа Leica DMIL HC (Leica, Германия).Число погибших клеток рассчитывают, как процентное соотношение междубис-бензимид позитивными клетками и пропидий иодид позитивнымиклетками по следующей формуле:Nм = (Npropidium iodide+/Nbisbenzimide+)×100%.2.2.7.5.Определение МТТ редуктазной активности для исследованиятоксичности HTLP на клетки линии RAW 264.7Сутьметодазаключаетсяввосстановлениибесцветноговодорастворимого 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиумабромида(МТТ)доголубыхкристалловформазановогопигментадегидрогеназами живых клеток.На 12-луночные пластиковые плоскодонные планшеты высеваютклетки RAW 264.7 в концентрации 1×105 на лунку 24-луночного планшета(Nunc).
Клетки отмывают раствором фосфатного буфера от клеточной среды,в которую добавляют 200 мкл раствора HTLP с концентрацией 200 мкг/мл,разведенного в культуральной среде. После инкубации в течение 24 часов,супернатант отбирают, клетки трижды отмывают раствором PBS. Затем вкаждую лунку вносят по 200 мкл среды без сыворотки и 10 мкл готового71раствора МТТ бромида (концентрация 5 мг/мл в фосфатном буфере).Инкубируют в условиях СО2-инкубатора в течение 4 часов. Далее растворМТТ убирают и клетки заливают изопропанолом-2.
Через 10 минут измеряютоптическую плотность спектрофотометрически при 570 и 620 нм.Расчет производят по формуле: А570 – А620 = Е.(Еопыта/Еконтроля)×100% = жизнеспособных клеток, %.Влияние HTLP на количество клеток линии RAW 264.72.2.7.6.Клетки в количестве 106 высевают на 90-милиметровые пластиковыене адгезивные чашки Петри и наращивают до 60–80% монослоя. Затемдобавляют по 100 мкл 200 мкг/мл культурального раствора HTLP и 0,9%изотонического раствора NaCl. Через 4 и 24 часа клетки промывают 0,1%PBS и заливают 250 мл смеси версен (0,02%): трипсин (0,25%) всоотношении 3:1.
Через 10 минут инкубации в СО2-инкубаторе клеткипипетируютиосуществляютподсчетклетокспомощьюручногоавтоматического цитометра Septer (Millipore). Учитывают клетки размером15–22 мкм.2.2.7.7.Иммуномодулирующая активностьИзучали способность выделенного полисахарида с молекулярноймассой 1–2 МДа (HTLP) влиять на продукцию цитокинов in vitro в культурахмононуклеаров периферической крови (МПК) здоровых доноров в дозах 1, 3,10, 30, 100 мкг/мл полисахарида без и с 10 нг/мл LPS.
Культуру МПКполучали методом градиентного центрифугирования с использованием смесификолл-верографина. Суспензию клеток/мл культивировали в среде RPMI1640 (Sigma-Aldrich, R8758), 10% FBS (Sigma-Aldrich, F2442), 2 мМ Lглутамина (Sigma-Aldrich, G7513), 20 мкг/мл гентамицина (Sigma-Aldricg,G1264), 2 мМ HEPES (Sigma-Aldrich, H4034), 2,8 М 2-меркаптоэтанола(Helicon, Am-04820-0.25), в объеме 1,5 мл/лунку в 24-луночной панели (Nunc,Дания) в течение 12 часов при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
Надосадочнуюжидкость, содержащую цитокины, собирали и хранили при –20 °C.72Количество и жизнеспособность клеток оценивали в камере Горяева вприсутствии 0,1% раствора трипанового синего (Sigma-Aldrich, T8154).2.2.7.7.1.Определение активности TNF-αАктивность TNF в надосадочных жидкостях определяли методом Раффи Гилфорд [240] на клетках L-929 (ATCC, CTL-1) из криохранилища ИМБРАН. Культивирование проводилось в среде 199 на растворе Хенкса(ПанЭко, C230п) с 10% FBS (Sigma-Aldrich, F2442) до образования монослояпри 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, в 96-луночныхплоскодонныхпланшетахсплотностью3×105клетоквлунке.Культуральную среду удаляли и вносили по 100 мкл двукратных серийныхразведений исследуемых образцов надосадочной жидкости и 100 мкл свежейсреды с актиномицином D (Sigma-Aldrich, 50-76-0) в концентрации 2мкг/лунку.
Клетки инкубировали 12 часов в тех же условиях. Для учетавыживших клеток в лунку панели заливали 0,2% раствор кристалл-виолетта(Sigma, C6158) в 2% этаноле на 15 минут, промывали проточной водой ивысушивали. Оптическую плотность окрашенных клеток определяли наспектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan (Великобритания) придлине волны 540 нм. В качестве стандарта были выбраны различныеконцентрации рекомбинантного TNF-α человека (Sigma-Aldrich, T6674). Дляпостроения калибровочной кривой применяли метод экспоненциальнойрегрессии.Отдельно был поставлен опыт с клеточной культурой RAW 264.7 свыключенными целевыми рецепторами, а также с антительной блокировкой.Контролем служили клетки, инкубированные с LPS (Sigma-Aldrich, L3024) вконцентрации 10 нг/мл в течение часа при 37 °C.
Количество посеянныхклеток в лцнку 24-луночного планшета (Nunc) – 105. Каждый экспериментставился в трех повторах.Вторым способом оценки влияния полисахарида на выработку факторанекрозаопухолейявляетсяизучение73экспрессиигеновTNF-αнамакрофагальной клеточной линии RAW 264.7 методом иммуноферментногоанализа с помощью набора Mouse TNF alpha Elisa Ready-SET-Go! (CatalogNumber: 88-7324) в двух экспериментах – с выключенными генами и спосадкой антител.
Экспрессия генов TNF-α на макрофагальной клеточнойлинии RAW 264.7 оценивали по уровню TNF-α в культуральной жидкости сиспользованием 96-луночного планшетного ридера (Abcam) при длине волны450 нм. Определение TNF-α производили через 4 и 24 часа (в случае сблокировкой антителами – только через 4 часа) после введения исследуемогопрепарата.Былисформированыгруппы:Контроль(инкубациясфизиологическим раствором); Опытная (с добавлением 100 мкг/мл HTLP);LPS (с добавлением к культуре без выключенных генов LPS); CR3-, Dectin-1,TLR-6-(культурысвыключеннымирецепторамисдобавлениемфизиологического раствора или с посадкой антител для блокировки целевыхрецепторов);CR3-,Dectin-1-,TLR-6-(культурысвыключеннымирецепторами или с посадкой антител для блокировки целевых рецепторов сдобавлением LPS 10 нг/мл); CR3-, Dectin-1-, TLR-6- (культуры свыключенными рецепторами или с посадкой антител для блокировкицелевых рецепторов с добавлением HTLP 100 мкг/мл).2.2.7.7.2.Определение активности IL-1βОпределение содержания IL-1β в супернатантах проводили с помощьюIL-1-чувствительной мышиной линии T-клеток хелперов клона D10.G4.1.Клетки культивировали в среде RPMI-1640, с добавлением 10% сывороткиплода коровы (Sigma-Aldrich, 548-62-9), 2 мМ L-глутамина, 50 мМ 2меркаптоэтанола (Helicon, Am-04820-0.25) и 10% мышиного ростовогофактора в качестве источника IL-2.
Источником ростового фактора служилсупернатант, полученный после 24-часового культивирования спленоцитовмышей линии DBS/2J в среде RPMI 1640 с добавлением 1% сыворотки плодакоровы в присутствии 1 мкг/мл конканавалина А. В качестве антигена ифидерных клеток были использованы кональбумин (Sigma-Aldrich, C7786) и74облученные клетки селезенки самцов мышей линии CBA/2 (H-2k),соответственно.Клетки D10.G4.1 (ATCC, TIB-224) использовали на 10–12-ый денькультивированияпоследобавленияантигенаифидерныхклеток,инкубировали в течение 65 часов в присутствии серийных разведений (1:20 –1:200) исследуемых надосадочных жидкостей в 96-луночных плоскодонныхпланшетах (2×104) в среде RPMI 1640 с добавлением 5% сыворотки плодакоровы, 2 мМ L-глутамина и 2,5 мкг/мл конканавалина А (Sigma-Aldrich,C5275) во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.
За 4 часа доокончания культивирования в культуру вносили 40 кБк (1 мкКи) на лунку 3Hтимидина. Клетки переносили на стеклянные фильтры и оценивалиинтенсивность включения радиоактивной метки с помощью жидкостногосцинтилляционного спектрофотометра [241].2.2.7.7.3.Определение активности IL-6Определение содержания IL-6 в супернатантах проводили с помощьюIL-6-зависимойгетерогибридомыD6C8[242].Серийныеразведениянадосадочных жидкостей и рекомбинантный IL-6 (NIBSC, код 89/45), вкачестве стандарта, инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах склетками (5×104 клеток/лунку) в 200 мкл при 37 °С. Клетки культивировали втечение 48 часов в RPMI 1640, содержащей 5% диализованную сывороткуAB группы крови человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
