Диссертация (1102418), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Количество клеток в макрофагальной линии RAW 264.7при совместном 24-ех часовом культивировании с HTLP.Название группыКоличествоклеток/млRAW 264.7 Контроль1 (физиологический раствор)355 800 ± 48 500RAW 264.7 Опыт 1 (HTLP, 200 мкг/мл)310 700 ± 48 7003.3.5. Влияние HTLP на продукцию TNF, IL-1β, IL-6 в культуремононуклеарных клеток человекаЦель состояла в исследовании влияния полисахаридов HTLP на синтезпровоспалительных цитокинов в МПК.Мононуклеары периферической крови (МПК) являются удобнойэкспериментальноймодельюдляоценкипродукциицитокиновиальтернативой определения их плазматического уровня. В культурах МПКразличных доноров уровень цитокинов отличается гетерогенностью и неявляетсястабильнымпризнаком.Динамичностьизменениябылапродемонстрирована в опыте (таблица 10). Положительным контролемслужат клетки, инкубированные с LPS в концентрации 10 нг/мл. Вид ответовна добавление полисахарида к культурам МПК различных доноров оказалсяпохожим.
Концентрации TNF-α в надосадочных жидкостях демонстрируютстимуляцию (в сравнении с контролем до 17,7 раз, с LPS – 6 раз) продукциицитокина у всех доноров.107Таблица 10. Уровень продукции TNF (пкг/мл) мононуклеарамипериферической крови здоровых доноров после 12-часовой инкубации сHTLP.№Дозы полисахарида, мкг/млКонтроль 131291 ± 26958 ± 101* 1534+LPS416 ± 14227 ± 6971 ± 27*1030100± 1488 ± 37* 1107134*±62*33 ± 561 ± 9*128 ± 11*40 ± 549 ± 1024 ± 6*33 ± 12*37 ± 12*32 ± 12*42 ± 11*199 ± 69*164 ± 33*252 ± 41*298 ± 17*15 ± 2*752 ± 53*784 ± 31*973 ± 119* 995 ± 76*+ LPS 52 ± 1335±1+ LPS 31 ± 8441 ± 3+ LPS 149 ± 335227 ± 21+ LPS 514 ± 1438826*1012 ± 93 2287± 2611± 3719± 3222± 3211+ LPS 2072 ± 68 239*211*229*261*297*324 ± 30*656 ± 58*522 ± 23*41767219 ± 6249 ± 2215*+ LPS 475 ± 34819 ± 4±177 ± 83*205 ± 31*+ LPS 56 ± 12* р < 0,05 (по сравнению с контролем).108237 ± 34*8 ± 2*4 ± 1*±±Результаты,приведенныевыше,демонстрируютстимуляциюпродукции TNF в культуре клеток.
Увеличение продукции цитокинов,которые являются радиопротекторами [270, 271], скорее всего, связано как сактивациейкультуральныхклеток,такисувеличениемскоростивысвобождения цитокина. А также с активацией клеток-продуцентов ворганизмеразличныхцитокинов(дендритныхклеток,макрофагов,стромальных клеток и др.), которые, в свою очередь, также стимулируютвыработку цитокинов.Продукция IL-1 была изучена на МПК человека выделенных оттрех разных доноров. Начальный уровень продукции IL-1 различался уисследуемых доноров (таблица 11). В культуре клеток первого донорапродукция цитокина была повышенной, тогда как в клетках второго доноранаблюдался спад уровня выработки IL-1.
В культуре третьего донорапродукция цитокина была очень высокой. В данном случае исследоваливлияние HTLP, добавленного к клеточным культурам МПК доноров вотсутствии (таблица 11) и присутствии LPS (таблица 12). Данныепоказывают, что при высокой продукции IL-1 (как спонтанной, так и LPSиндуцированной) внесение полисахарида HTLP в клеточные культурыдоноров влекло за собой снижение количества высвобождаемого IL-1 (донор1 и 3). Напротив, при низкой продукции цитокина (донор 2) наблюдаласьстимуляция высвобождения IL-1.Такая же закономерность наблюдалась вкультурах МПК трех доноров, стимулированных LPS (таблица 12).Соответственно, при воздействии полисахарида на культуры МПК доноровподавляется высокий уровень продукции IL-1 и стимулируется низкийуровень LPS-индуцированной продукции IL-1 [272].109Таблица 11.
Уровень продукции IL-1 в зависимости от дозировкиполисахарида в отсутствии LPS из N. Meningitidis (0,1 мкг/мл).№Дозы полисахарида, мкг/млКонтроль1 17223 ± 16451310301005496 ± 3478056 ± 9565250 ±9371 ± 8511872 ±4712165 ± 123 51331 ± 3426867 ± 77*6558 ± 4721931287 ±202 ±122 ± 11380 ±107*25*28712 ±3649 ±29117 ±6189 ±3111243621942525*Таблица 12. Уровень продукции IL-1 в зависимости от дозировкиполисахарида в присутствии LPS из N. Meningitidis (0,1 мкг/мл).№Дозы полисахарида, мкг/млКонтроль1 14533 ± 1541131018145 ±13541 ± 9773058 ±1671242 ± 3128 ± 14*301547 ± 98 3471 ±212142 ± 17*200 ± 25*100313143 ± 16143 ±15*34113 ± 356558 ± 47218651 ±3557 ±2971 ±489 ±144131221145Продукция IL-6 также была исследована в культурах МПК трехдоноров в отсутствии (таблица 13) и присутствии LPS (таблица 14).
Былозамечено отсутствие вариабельности в начальных уровнях IL-6 этих культур.Внесение полисахарида в клеточные культуры доноров приводило кстимуляции выработки IL-6, одинаковой у двух доноров, за исключениемслучая нестимулированной культуры донора 3. Однако можно былонаблюдать индивидуальные различия стимуляции продукции IL-6 взависимости от доз углевода.
Малые концентрации полисахарида (1–3110мкг/мл), у двух доноров – 2 и 3, только стимулировали выработку LPSиндуцированного IL-6. Подобная стимуляция наблюдалась после внесения вклеточную культуру МПК донора 3 углевода в пределах диапазона доз 10–30мкг/мл. Стимуляция продукции IL-6 в культурах МПК необработанных LPSпроисходила только при добавлении к ним относительно высоких дозполисахарида (доноры 1 и 2), тогда как у донора 3 не была обнаруженаподобная стимуляция продукции IL-6. Однако, при больших концентрацияхкарбогидрата, возможно, будет наблюдаться подобная стимуляция.Таблица 13.
Уровень продукции IL-6 в отсутствии LPS из N.Meningitidis (0,1 мкг/мл).№Дозы полисахарида, мкг/млКонтроль1310301001605 ± 57687 ± 52794 ± 91806 ± 731147 ± 128841 ± 812481 ± 42544 ± 44*537 ± 41* 1463 ± 125*1486 ± 131840 ±57*3566 ± 59323 ± 29265 ± 18256 ± 21301 ± 16318 ± 25Таблица 14. Уровень продукции IL-6 в присутствии LPS из N.Meningitidis (0,1 мкг/мл).№Дозы полисахарида, мкг/млКонтроль1310301001641 ± 511145 ± 1311040 ± 100756 ± 621160 ± 98841 ± 812870 ± 76870 ± 34*841 ± 67*1040 ± 1001465 ± 133943 ±93*3456 ± 351040 ± 1001065 ± 124400 ± 19389 ± 25531 ± 45Полисахарид регулирует скорость выработки IL-1, угнетая высокуюпродукцию и стимулируя низкую.
Учитывая отсутствие побочных эффектов,характерных для парентерального введения IL-1, TNF или LPS, возможнопредположить наличие у полисахарида мягкой стимуляции системы111провоспалительных цитокинов и активации иммунологической защиты(увеличение скорости выработки антагонистов). В то же время характервоздействия HTLP на цитокин IL-1 свидетельствует о наличии уполисахарида иммуномодулирующей активности.Определение уровня цитокинов в супернатантах мононуклеаровпериферической крови имеет свои особенности. С одной стороны методобеспечивает возможность исследования влияния различных соединений насинтез цитокинов. С другой стороны, его трудно стандартизовать, так какисходно, у доноров, могут быть завышенные значения цитокинов.
Так,например, высокий уровень IL-6 в плазме является признаком тяжелойтравмы, а IL-1 повышается при стрессовых ситуациях, тяжелой физическойнагрузке, наличием воспалительного процесса и т.д. К тому же, рядцитокинов в плазме крови могут быть связаны с белками-переносчиками иразличными ингибиторами. При этом цитокины могут не обладатьбиологической активностью.
Все эти нежелательные моменты можно обойти,используя культуру клеток.Вместе с тем в модели влияния полисахарида на выработку TNF-α вмакрофагальной клеточной линии RAW 264.7 были получены следующиерезультаты, представленные в таблице 15. Из полученных данных видно, чтовведение HTLP в культуру клеток стимулирует выработку TNF-α, при этомуровеньстимуляциипримерноравенуровнюстимуляциилипополисахаридом, который в свою очередь статистически значимоотличается от контроля. Данные воспроизводятся через 4 и 24 часаинкубации культуры клеток с HTLP, LPS и физиологическим раствором[273].112Таблица 15. Влияние HTLP на продукцию TNF-α клеточной линииRAW 264.7 после 4 и 24 часов инкубации.TNF-α в культуральной TNF-α в культуральнойГруппа№№жидкости (М ± SD), жидкости (М ± SD),пкг/мл, 4 часапкг/мл, 24 часа3,18 ± 1,1116,21 ± 7,0683,13 ± 7,34*129,5 ± 11,87*100,49 ± 9,54*131,85 ± 13,20*Контроль1физиологическийраствор2Опыт – HTLP, 100мкг/млLPS3(физиологическийраствор)*-достоверное различие с контролем (критерий Манна-Уитни) (p<0,05).Для того, чтобы изучить возможность вовлечения рецепторов CR3,Dectin-1 и TLR-6 в опосредование провоспалительных ответов HTLP, былоисследовано влияние генных конструктов, подавляющих экспрессию белковэтих рецепторов на способности HTLP вызывать выработку TNF-αмакрофагальными клетками RAW 264.7 после 4 часов инкубации и после 24часовой инкубации (таблица 15).ПредварительнобылапроведенаоценкавлиянияHTLPнажизнеспособность и пролиферацию макрофагальных клеток линии RAW264.7 (таблицы 7, 8, 9).3.3.6.
Инактивация генов целевых рецепторов и продукция TNF-αИз табличных данных (таблицы 16 и 17) и на рисунках 19 и 20 видно,что HTLP, как и LPS является стимулятором выработки TNF-α. В сравнениис контролем уровень выработки увеличился в 18,3 раза в случае HTLP и в23,2 – LPS на 4-ый час, а на 24-ый – в 7,4 и 7,3 раза, соответственно.Контрольные значения TNF-α в культурах с единичными выключенными113рецепторами в пределах погрешности не отличались от контроля безвыключенных рецепторов.
В свою очередь HTLP не стимулирует выработкуTNF-α в культурах с выключенными генами рецепторов TLR-6 и Dectin-1 впределах погрешности, что может свидетельствовать о том, что для HTLPнеобходимы оба рецептора для корректной активации клеток и выработкиTNF-α. Учитывая значительную молекулярную массу 1–2 МДа, можнопредположить, что активация происходит путем одновременного связыванияобоих TLR-6 и Dectin-1 рецепторов, что обуславливает действие HTLP наклеточные системы и организм.Таблица 16. Влияние HTLP и LPS на продукцию TNF-α клеточнойлинии RAW 264.7 с инактивированными генами целевых рецепторов CR3,Dectin-1 и TLR-6 после 4 часов инкубации.TNF-α в культуральнойГруппа№жидкости (М±SD), пкг/мл1Контроль – физиологический раствор4,47 ± 1,562Дектин-1 (физиологический раствор)6,57 ± 1,003CR3 (физиологический раствор)6,92 ± 2,124TLR-6 (физиологический раствор)4,44 ± 2,65LPS (физиологический раствор)103,66 ± 9,60*6LPS – Дектин-1 (физиологический раствор)63,03 ± 6,42*7LPS – CR3 (физиологический раствор)57,36 ± 5,56*8LPS – TLR-6 (физиологический раствор)70,88 ± 7,12*9Опыт (HTLP, 100 мкг/мл)81,71 ± 7,82*10 Дектин-1 (HTLP, 100 мкг/мл)10,03 ± 3,8411 CR3 (HTLP, 100 мкг/мл)69,78 ± 7,02*12 TLR-6 (HTLP, 100 мкг/мл)10,53 ± 2,56114Таблица 17.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
