Диссертация (1102418), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Экспериментальная модель дляпроверки пирогенности на кроликах была выбрана вместо LAL-теста в силуложно положительной реакции последнего на наличие β-глюканов в образце.95Рисунок 10. Хроматографический профиль выделения фракции 1–2 МДа наToyopearl HW-75 XK50/100 (кривая синего цвета – поглощение при длиневолны 210 нм; кривая коричневого цвета – регистрация кондуктометром,остальные – показатели давления в системе). На оси ординат отложеныотносительные единицы поглощения, на оси абсцисс – миллилитры.3.1.2.3.ДляВЭЖХ-ГПХ фракции из Helianthus tuberosus L.получениявысокойчистотыполисахаридногопродуктанеобходимой для структурных характеристик использовали ВЭЖХ-ГПХ. НаколонкуTSKG6000PWнаносилипервыйпик,полученныйпослехроматографии на Toyopearl HW-75.
Профиль элюции показал только одинединственный, симметричный, узкий пик (рис. 11), что свидетельствовало одостаточной однородности полученного материала. Время удержания96основной фракции препарата составляло около 9,5 мин. Молекулярная массасоставляла 1–2×106 Да.Рисунок 11.
Хроматограмма ВЭЖХ-ГПХ выделения фракции полисахаридовHTLP в 0,1 M Na2HPO4 с pH 6,8 + 0,1 M NaCl, потоке 1 мл/мин.Детектирование на длине волны 220 нм. На оси ординат отложеныотносительные единицы поглощения, на оси абсцисс – минуты.Пиксобирали,диализовалипротивдеионизованнойводыивысушивали. Все дальнейшие работы и эксперименты были проведеныименно с этим веществом под названием HTLP.3.2.Физико-химические характеристики HTLPТрадиционные физико-химические свойства HTLP: порошок беловатосероватого цвета, без запаха, хорошо растворим в воде и нерастворим ворганических растворителях.Были изучены спектральные характеристики полисахарида HTLP.3.2.1.Спектральные характеристики3.2.1.1.УФ-спектр HTLPНа рисунке 12 представлен УФ-спектр образца HTLP в интервале длинволн 190–1100 нм. На спектре присутствует максимум в области 190–210 нм,97характерный для полисахаридов, и небольшой максимум в области 280 нм,характерный для белковой молекулы, что позволяет предположить наличиебелка в этом соединении.Рисунок 12.
УФ-спектр образца HTLP.3.2.1.2.ИК-спектр HTLPИК-спектр представлен на рисунке 13, в таблице 4 приводятся данныепо интенсивностям и волновым числам колебаний изучаемого вещества.98Рисунок 13. ИК-спектр полисахарида HTLP.Таблица 4. Интенсивности и волновые числа колебаний полисахарида HTLP.В ИК-спектре полисахарида HTLP отмечаются полосы поглощения:3338 см–1 (О − ); 2922, 2853 см–1 (С–− ); 2361, 2342 см–1 (= + − , ≡N+ ,=N+2 ); 1651, 1645 см–1 (С=С, кристаллизационная вода) 1028, 1076, 1150см–1 (С–О, С–О–С, кольцевые колебания пиранозного цикла); в области1000–1200 см–1 (сильная и широкая полоса) — характеризует OH, связаннуюводороднойсвязью;поглощениеоколо1740см–1соответствуеткарбоксильной группе, указывающей на существование уроновых кислот в99полисахариде [262, 263] сильные поглощения на 1074 и 1024 см–1, средниепоглощение на 1148 см–1, при наличии колебаний пиранозного кольца,означают структуру, присущую β-глюкану.
ИК-спектр полисахарида HTLPпоказал характерные для полисахаридных структур полосы поглощения [264,265].ЯМР-спектр HTLP3.2.1.3.Былопроведеноструктурноемагниторезонансноеисследование,результатом которого является предположительная структура полисахарида.Данные по13C и 1H ЯМР спектру представлены на рисунках 14 и 15, аданные, полученные с помощью программы CASPER и NMRgraph послеобработки первичных значений пиков (автоматический подбор ближайшихзначений из базы данных) – в таблице 5.
Данные использовались дляпредварительного воссоздания предположительной структуры молекулы спомощью программного обеспечения CASPER и NMRgraph, в результатечего была определена возможная структура полисахарида: →3)-β-D-Glc(1→4)-α-D-GalA-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-Tyv-(1→4)-α-D-Gal-(1→ - цепь (14) связанной α-D-Галактопиранозы, частично связанной с уроновымикислотами(D-ГалактауроновойиD-Глюкуроновой),(1-4)-связаннойглюкопиранозой, тивелозой (3,6-дидэзокси-D-арабино-гексозой) и (1-3)связанной α-D-Галактопиранозой, предположительно входящими в составарабиногалактана первого типа [266].
Обращает на себя внимание фактналичия тивелозы в предположительной структуре HTLP. Тивелоза ранеебыла определена как компонент грамотрицательных бактерий. Возможно,появление тивелозы в описанной структуре связано с ограничениями метода,прииспользованииегодляисследованияподобногородавысокомолекулярных соединений.
Можно предположить, что на местетивелозы в структуре полисахарида находится одна из возможныхмодификаций глюкозы (но не тивелоза, паратоза, колитоза и другие,100специфичные для бактерий). Для более полной характеристики HTLPтребуютсядополнительныеЯМРРисунок 14. 1H ЯМР-спектр полисахарида. Растворитель 2 .Рисунок 15.
13C ЯМР-спектр полисахарида. Растворитель 2 .101исследования.Таблица 5. Данные 13C и 1H ЯМР-спектра HTLP после обработки CASPER.Пики1H ЯМР (ppm)5,38, 5,21, 4,79, 4,19, 3,93, 3,91, 3,80, 3,61, 3,41, 3,39, 3,37,2,11, 1,2013C ЯМР (ppm)99,62, 97,67, 80,37, 76,73, 73,34, 71,51, 71,16, 69,30, 60,40Из этих данных было получено приблизительное (одно из возможных)графическое отображение структуры молекулы, представленное на рисунках16 и 17 [267].Рисунок 16. Вид полисахарида «сбоку».102Рисунок 17. Вид полисахарида «снизу».3.2.2.Моносахаридный состав HTLPМоносахаридный состав кислотного гидролизата полисахарида HTLPпредставлен на рисунке 18.Проведённое исследование показало, что полисахарид HTLP имеетследующий моносахаридный состав: Glc – 30%, GalA – 23%, GlcA – 15%, Gal–13%, Rha – 6%, Ara – 4%, Man – 3%, Xyl – 2% [268].103Рисунок 18.
Анализ моносахаридного состава кислотного гидролизатаполисахарида HTLP.С учетом превращений Glc в GlcA во время кислотного гидролизаможно утверждать, что препарат по моносахаридному составу является восновном глюканом.Определение количества белка методом Лоури и сахара методомДюбуа в полисахариде HTLP показало 0,5% белка и 85% карбогидратов.3.2.3.Обработка ферментами, специфичными к β-(1→4) и к β-(1→3)гликозидным связямСовместная обработка ферментами литиказой из Arthrobacter Luteusспецифичной к β-(1→3)-гликозидным связям и целлюлазой из Aspergillusniger специфичной к β-(1→4) и в некоторой степени к β-(1→3)-гликозиднымсвязям приводила к практически полной потере активности полисахарида вмодели стимуляции антителообразующих клеток (п. 3.3.2).1043.3.Биологическая активность3.3.1.
Стимуляция антителообразующих клеток в селезенках мышей послесовместного введения HTLP с ЭБПослесовместноговведениямышамлинииF1(CBA×C57Bl/6)полисахарида HTLP и ЭБ 2×106 была выявлена стимуляция выработкиантител к ЭБ в клетках селезенок мышей. Результаты экспериментапредставлены в таблице 6.Таблица 6. Стимуляция антителообразующих клеток в селезенкахпосле совместного введения HTLP и 2×106 ЭБ.Образец, мкг/мышьАОККст*1200 ± 164,310502 ± 7510,7100743 ± 8015,81000927 ± 9419,7Контроль47 ± 6-* - отношение числа АОК в опыте к числу АОК в контроле3.3.2. Стимуляция антителообразующих клеток в селезенках мышей послевведения HTLP, обработанного литиказой и целлюлазойПолисахарид HTLP в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкг/мышьпредварительно обрабатывали литиказой и целлюлазой (Материалы иметодып.Обработкаферментами).Послеинактивацииферментовгидролизаты HTLP совместно с ЭБ 2×106 внутрибрюшинно вводили мышамлинии F1(CBA×C57Bl/6).В результате обработки ферментами адъювантная активность HTLPпрактическиполностьюисчезала.Так,например,полисахаридныйгидролизат HTLP 1, 10, 100 и 1000 мкг/мышь после обработки литиказойпоказал 59 ± 6, 62 ± 6, 68 ± 7, 75 ± 8 АОК соответственно, а контроль – 65 ± 7АОК.
Аналогично, обработка 1, 10, 100 и 1000 мкг/мышь HTLP целлюлазой105составило 82 ± 8, 85 ± 9, 104 ± 12, 115 ± 12 АОК соответственно, против 83 ±9 АОК в контроле. Остаточная стимуляция, скорее всего, обусловленавлиянием недогидрализованных мономеров полисахарида, как образовпатогенности, на клетки иммунной системы, которые распознают их исекретируют цитокин, активирующие пролиферацию спленоцитов [269].3.3.3.
Оценка цитотоксичности HTLP для клеток линии RAW 264.7В таблице 7 приведены данные по цитотоксчиности HTLP в моделимакрофагальной клеточной линии RAW 264.7. Из полученных данных видноотсутствие достоверного отличие от контроля у HTLP.Таблица 7. Жизнеспособность клеток линии RAW 264.7 через 24 часапосле добавления полисахарида HTLP путем окрашивания культур клетокпропидий иодидом.Название группы% мертвых клеток в культуре (М ± SD)RAW 264.7 Контроль2,76 ± 0,25RAW 264.7 HTLP2,99 ± 0,54(200 мкг/мл)3.3.4.
Определение МТТ редуктазной активности для исследованиятоксичности HTLP на клетки линии RAW 264.7Таким образом, культивирование макрофагальных клеток линии RAW264.7 с полисахаридом HTLP в концентрации 200 мкг/мл в течение 24-ехчасов не приводило к достоверному увеличению процента мертвых клеток вкультурах клеток линии RAW 264.7 по определению МТТ-редуктазнойактивности и окрашиванию культур клеток пропидий иодидом (таблица 8 и9).Также,вэтомслучае,ненаблюдалимакрофагальных клеток (таблица 9).106увеличенияколичестваТаблица 8. Жизнеспособность клеток RAW 264.7 через 24 часа последобавления HTLP путем определения МТТ-редуктазной активности.Название группыКоличество жизнеспособных клеток, %RAW 264.7 Контроль99,97 ± 3.67RAW 264.7 HTLP (200 мкг/мл)103,00 ± 3,78Таблица 9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
