Диссертация (1102418), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

В нормальном состоянии клетки уровеньпроапоптотическогосигналанизок,вероятностьпереходавпредапоптотическое состояние мала, и клетка выживает, несмотря наприсутствие HTLP. В трансформированной(использовалсяпараметрдляучетаклетке ситуация другаяразличийвсостоянияхтрансформированных и нормальных клеток). При воздействии HTLPпроапоптотический сигнал может превысить некий пороговый уровень, ипроисходит бифуркация: состояние клетки становится неустойчивым, и сбольшой вероятностью она может перейти не только в предапоптотическоесостояние, но и к апоптозу.

В связи с этим представляется возможнымописание такого бифуркационного поведения клетки с помощью всего двухпеременных, выбранных специальным образом.Все реакции в регуляторных путях происходят самопроизвольно(имеются в виду не элементарные, а суммарные реакции, связанные спереносом сигнала между узлами регуляторной сети.), т.е. с понижениемэнергии Гиббса системы, поэтому клетку можно рассматривать как активнуюсреду.

В качестве обобщенной координаты x будем использовать некуюусловную функцию состояния графа реакций в регуляторной сети, такую, чтодля реакций на клеточной мембране она равна нулю, а в «геноме» – единице.Две переменные, описывающие поведение клетки, зависят от координаты ивремени и соответствуют вероятностям формирования сигналов для выборапроапоптотического или противоапоптотического пути. Поскольку узлов вграфе реакций много, перенос сигнала по обобщенной координате можноописать как диффузию [246].

В дальнейшем под диффузией понимаетсяименно такой перенос сигнала.Для описания поведения клетки в ответ на воздействие HTLPпредлагаетсяиспользоватьмодифицированнуюФитцХью-Нагумо [247]:87системууравнений2− 2 − 2 2 22 2= −( − )( − 1) + ,= − + (),сходную с использованной ранее при моделировании структурообразованияв урбоэкосистемах [248]. Система решается численно, при этом на границахобласти расчета задаются краевые условия Неймана.В этой системе безразмерные переменные u и v соответствуютвероятностям формирования про- («активатор») и противоапоптотического(«ингибитор»)сигналасоответствующих(можносигналов).говоритьПараметрыDuииобDvинтенсивностях–безразмерныекоэффициенты диффузии, (t) > 0 – кинетический параметр взаимодействияактиватора и ингибитора,  – параметр активации системы,  – кинетическийпараметр затухания противоапоптотического сигнала,  – кинетическийпараметр, позволяющий учесть различие в скоростях распространения про- ипротивоапоптотического сигнала.

Связь параметров модели с реальнымихарактеристиками сигнальной сети и их численные оценки будут приведеныниже.Длямногихинтермедиатоврегуляторныхреакцийхарактерныколебания чисел молекул с разными средними значениями периодов. Так,количество молекул SODD (NSODD) в цитоплазме осциллирует со среднимпериодом около 10 мин [249]. Оценка среднего периода колебаний числамолекул c-FLIP (Nc-FLIP) на основе данных работы [250] дает значение около15 мин. Для упрощения задачи колебания чисел молекул аппроксимированыгармонической функцией, при этом() = 0,2 + 0,05 sin(0,004),где время t выражено в секундах.

Для среднего значения Nc-FLIP получаетсязначение 1475 (изменения в пределах от 950 до 2000), что не противоречитизвестным данным [251]. Количество рецепторов TNFR1 (NTNFR1) наклеточной мембране составляет от 500 до 5000 [252], а при внесении HTLPсинтезируется около 1200 молекул TNF, поэтому в качестве оценки можно88принять, что число тримеров рецепторов с лигандом равно 400. Предельноезначение NSODD равно количеству связанных триплетов (TNF–TNFR1)3 (N(TNFTNFR1)),т. е. 400.Для оценок других параметров модели надо определить количествосайтов связывания HTLP с рецепторами Dectin-1 и TLR-6.

Для связывания срецепторами требуется последовательность из 10–11 мономеров глюкозы с β(1→3) или β-(1→4) гликозидной связью [253]. Средняя молекулярная массаHTLP составляет 1,5 МДа, и он содержит около 30% глюкозы смолекулярной массой около 180 Да, поэтому в качестве оценки количествасайтов связывания с рецепторами β-глюканов на молекуле HTLP (NHTLP)можно принять значение 250, при этом максимальное значение составляетоколо 330.Параметрактивациисистемыαпропорционаленчислусайтовсвязывания полисахарида и обратно пропорционален числу рецепторовсвязывания – Dectin-1 и TLR-6. На клеточной мембране находится примерно600 рецепторов Dectin-1 (NDectin) [254, 255] и около 15 димеров рецепторовTLR-2/TLR-6 (NTLR-6) [256, 257].

Для оценки параметра α можно использоватьсоотношение:= +−6⋍ 0,4-параметрактивациисистемы.Кинетический параметр затухания противоапоптотического сигнала γ можнооценить по соотношению: =−6 +(−1) +−=415400+1475⋍ 0,2.Для коэффициентов диффузии можно получить оценки на основанииформулы Эйнштейна: =2, где x = 1, а ti – время переносасоответствующего сигнала. Время формирования каспазного комплекса и егомиграция к ДНК может составлять 15 мин (0,25 ч) [258], поэтому: =10,25=4. Время формирования комплексов белков p50 и p65 с ДНК по пути черезNF-κB может составлять 30 мин (0,5 ч) [250, 259, 260], поэтому: =10,5= 2.Для кинетического параметра ε принято значение 0.01, позволяющееполучитьповедениемодели,согласующееся89сэкспериментальнымиданными.

Период полураспада TNF составляет около 4 ч, и ему долженсоответствовать период осцилляций T во всей системе регуляции, но дляудобства счета в модели использовано безразмерное время (нормированноена T).903. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1.Выделение и очистка полисахарида3.1.1. Выделение грубой фракции из Helianthus tuberosus L.Грубую вытяжку из Helianthus tuberosus L. получают путем экстракциигомогената коркового слоя клубней горячей деионизированной водой споследующимполучениемэкстрактапутемотжима.Экстрактфракционируют с помощью ультрафильтрации.

Собирают фракции смолекулярной массой более 300 кДа (Материалы и методы п. 2.2.3) илиофильно высушивают (с использованием лиофилизатора Virtis Advantage2.0 BenchTop Freeze Dryer / Lyophilizer, SP Scientific, США) с градиентомтемпературы 10 °C до – 50 °С для дальнейшего фракционирования и анализа.Конечный очищенный продукт был назван HTLP. Схема его полученияпредставлена на рисунке 8.91Рисунок 8. Схема процесса выделения HTLP из Helianthus tuberosus L.923.1.2. Очистка грубой фракции из Helianthus tuberosus L.хроматографическими методами3.1.2.1.Анионообменная хроматография фракции с молекулярноймассой более 300 кДа полученной из Helianthus tuberosus L.Навеску фракции с молекулярной массой более 300 кДа растворяют вдеионизированной воде в соотношении 1 мг в 1 мл в течение 1 часа, намагнитной мешалке при +4 °С.

Центрифугируют при 4000 об/мин в течение10 минут. К осадку вновь прибавляют деионизированную воду, и процедуруповторяли до отрицательной реакции на сахара по реакции с фенолсернойкислотой.Водныеэкстрактыобъединяют,концентрируют.Осадкилиофильно высушивают [261].Концентраты водных экстрактов наносят на колонку DEAE 650 S TSK(26 х 350 мм), уравновешенную деионизованной водой.

Колонку элюируютводой, а затем проводят ступенчатую элюцию 0,5 М KCl, 1 М KCl и 2 М KCl.Наличие сахаров определяют по качественной реакции с фенолсернойкислотой. Все полученные фракции диализуют против дистиллированнойводы и лиофильно высушивают. Профиль элюции представлен на рисунке 9.Рисунок 9. Анионообменная хроматография на DEAE 650 S TSK колонкефракции с молекулярной массой более 300 кДа полученной из Helianthustuberosus L.

Кривая А – поглощение при 490 нм (мониторирование сиспользованием фенолсернокислотного метода), кривая В – поглощение при220 нм.93Использование анионнообменной хроматографии позволило разделитьконцентраты водных экстрактов на фракции, различающиеся силой заряда.Анализировали три пика, обнаруживаемые на кривой поглощения при 490 нм(рис. 8), которые разделили на три части: 1–10 пробирки (пик 1),элюирующиеся водой; 11–14 пробирки (пик 2) и 15–22 пробирки (пик 3).Первый пик представляет собой нейтральные полисахариды, а второй итретий–отрицательнозаряженныеполисахариды.Фракциипиковобъединяли, диализовали против деионизованной воды и лиофильновысушивали. Фракции тестировали на наличие адъювантной активности.

Втаблице 2 и таблице 3 представлены выходы полученных фракций, и ихбиологическая активность.Таблица 2. Фракции после хроматографирования на DEAE 650 S TSKфильтрата с молекулярной массой более 300 кДа полученного из Helianthustuberosus L.Фракции /Нейтр.Нераствор-я0,5 М KCl,1 М KCl,2Мактивностьпс., %осадок, %%мгKCl, мгСостав17,6218,9975,68следыследыАдъювантнаянет-++++-активностьТаблица 3. Сравнительное содержание АОК к ЭБ через 4 дня послевнутрибрюшинного, совместного с ЭБ введения фракций, полученных послеионообменной хроматографии и гельфильтрации, у мышей.ОбразецКоличество АОК (анти-ЭБ)2106 ЭБ34  32106 ЭБ + 0,5 М KCl*0,15103  42(DEAE 650 S TSK)64  82106 ЭБ + 1 М KCl*(DEAE 650 S TSK)2106 ЭБ + 1-й пик*0,33103  9594(Toyopearl HW-75)24  42106 ЭБ + 2-й пик*(Toyopearl HW-75)* Вводимая доза 10 мкг/мышьКак видно из таблиц 2–3 адъювантной активностью обладает фракция,которая элюируется с анионообменника 0,5 М раствором KCl.3.1.2.2.Гель-фильтрационная хроматография фракции санионообменника из Helianthus tuberosus L.Материал, полученный после элюции с анионообменника 0,5 М KCl,хроматографируют на колонке с Toyopearl HW-75, уравновешенной 0,01 Мтрис-буфером pH 6,6, затем элюировали тем же раствором (рисунок 10).Профиль элюции показал наличие нескольких пиков.

Первый пик (I)выходил в районе 325 мл и полностью совпадал с выходом голубогодекстрана (Молекулярная масса 1–2×106 Да), второй пик (II) – 1400 мл. Всепики были собраны, диализованы против деионизованной воды, высушены.Проводили контроль фракций на наличие адъювантной активности, котораябыла обнаружена в первом пике (таблица 3). Для дальнейшего анализа былиспользован только первый пик.При проверке на пирогенность (Материалы и методы п. 2.2.7.1) ни однаиз исследуемых доз 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл не приводила к статистическизначимому повышению температуры у подопытных животных. Усредненноезначение по пяти животным для опытной группы 1, 10, 100 и 1000 мкг/млсоставило до введения: 38,8 ± 0,2 °C, 38,7 ± 0,1 °C, 38,7 ± 0,2 °C и 38,9 ± 0,3°C, после: 38,8 ± 0,2 °C, 38,7 ± 0,2 °C, 38,8 ± 0,1 °C и 38,9 ± 0,2 °Cсоответственно, для контроля – 38,8 ± 0,1 °C.

Характеристики

Список файлов диссертации