Диссертация (1102418), страница 13
Текст из файла (страница 13)
За 4 часа до окончания культивирования вкультуру вносили 40 кБк (1 мкКи) на лунку 3H-тимидина. Клетки переносилинастеклянныерадиоактивнойфильтрыметкисиоценивалипомощьюинтенсивностьжидкостноговключениясцинтилляционногоспектрофотометра [242].2.2.7.7.4.Индукция интерферона in vivo и in vitroIn vitro продукцию IFN оценивали по количеству данного лимфокина внадосадочной жидкости 24-часовой культуры лейкоцитов крови здоровыхдоноров под воздействием госсипола и полисахарида по сравнению с75контрольнымипробами,гдевкачествеиндукторовинтерферонаиспользовали вирус болезни Ньюкасла и стафилококковый энтеротоксин А.Индукцию IFN проводили на пробах цельной крови in vitro,полученной от 10 здоровых доноров по модифицированной методикеГригорян С.С.
с соавторами. К 1–2 мл венозной крови доноров добавляютгепарин конечной концентрации 10 ед/мл. В 800 μl среды RPMI-1640 вносятпо 100 μl гепаринизированной крови доноров и по 100 μl исследуемыхобразцов. Раствор полисахарида и госсипола исследовали на способность киндукции биосинтеза IFN в концентрациях 10 и 50 мкг/мл среды. В качествеположительных контролей интерферониндуцирующей активности на клеткахкрови использовали широко известный индуктор -IFN стафилококковыйэнтеротоксин А (СЭА) в концентрации 10 мкг/мл и общепринятый индукторα-IFN вирус болезни Ньюкасла (ВБН) в инфекционной дозе 105.
В качестверастворителя использовали RPMI-1640. Пробы инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем центрифугировали при 800 об/мин 5 минут,супернатант отбирали и хранили при 2–8 °С для дальнейшего определениятитров IFN.Индукцию IFN in vivo госсиполом и полисахаридом изучали на мышахлинии C57Black/6. Госсипол и углевод вводили животным внутрибрюшиннов объеме 0,2 мл по 25 мкг/мл.
Через 6 часов после введения этих агентовкровь у животных забирали, получали сыворотки, в которых определялиуровень сывороточного интерферона.Титрование супернатанта IFN, полученной как in vitro, так и in vivo,проводилимикрометодомнапластиковых96-луночныxпанеляхводнодневной культуре фибробластов человека М-19 (фибробласты человека)в полной среде RPMI с добавление пенициллина и стрептомицина по 100ед/мл и 10% FBS.
Объем каждой пробы с двумя повторами составлял 200 μl.Величина, обратная разведению IFN, тормозящая на 50% развитиедеструкции монослоя (цитопатическое действие) фибробластов вирусомэнцефаломиокардитамышей(определялось76сиспользованиеминвертированного микроскопа) отражала биологическое действие IFN.Активность интерферона в исследуемых супернатантах выражали в единицахактивности(МЕ/мл)международногостандарта1369/19,которыйрассчитывали по национальному pефеpенц-пpепаpату F9, изготовленному вНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи PАМН.Для статической обработки цифровых экспериментальных данныхиспользовали вариационную статистику c учетом t-критерия Стьюдента.2.2.7.7.5.Стимуляция натуральных киллеровВ качестве клеток-мишеней использовали клетки миелолейкозачеловека (К-562), меченые 3Н-уридином в дозе 3 мкКи на 1 мл клеточнойкультуры. Рабочая концентрация клеток составляла 105. В качестве клетокэффекторов использовали лимфоциты периферической крови человека(ЛПК).
У людей в пробирку с гепарином – 100 ед/мл забирали кровь излоктевой вены для оценки иммунного статуса. Для выделения ЛПКгепаринизированную кровь разбавляли 1:2 сбалансированным солевымраствором и наслаивали на фиколл-метризоат натрия, плотность – 1,077.Центрифугировали 15 мин при 1000g. Слой ЛПК отбирали c поверхностираздела плазма-фиколл, и отмывали дважды солевым раствором Хенкса.Затем ресуспендировали до 107 кл/мл в общей среде. Культивированиеклеток-эффекторов производилось in vitro с раствором полисахарида вобъеме100мкг/лункусутки.Влункикруглодонной96-луночноймикропланшеты добавляли по 100 мкл клеточной суспензии эффекторов иклеток-мишеней в соотношении 100:1 и 10 µl РНКазы, 5 мкг/мл. Ставилось 5параллелей.Вкачествеконтроляиспользоваликлетки-мишенибездобавления клеток-эффекторов и клетки-мишени с добавлением такого жеколичества полисахарида, не обработанного ферментами и обработанногоферментами.ПланшетинкубироваливСО2-инкубаторе14часов.Содержимое ячеек переносили с помощью харвестера на фильтры (Whatman)иотмывалифизиологическимраствором,77затем5%растворомтрихлоруксусной кислоты и 95% этанолом.
Высушенные фильтры помещаливо флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость.Инактивация генов целевых рецепторов2.2.7.8.Для инактивации были использованы следующие синтезированныеолигонуклеотидныепоследовательности,комплементарныефрагментамцелевых рецепторов:ITGB2 (CR3)ITGB2, sh1dir15’-phosphogatccgCCTACTATAAACTCTCCTCTACACGTGTAGAGGAGAGTTTATAGTAGGtttttgITGB2, sh1rev15’-phosphoaattcaaaaaCCTACTATAAACTCTCCTCTACACGTGTAGAGGAGAGTTTATAGTAGGcgCLEC7A (Dectin-1)CLEC7A, sh2dir15’-phosphogatccgGCGACACAATTCAGGGAGAAACACGTGTTTCTCCCTGAATTGTGTCGCtttttgCLEC7A, sh2rev15’-phosphoaattcaaaaaGCGACACAATTCAGGGAGAAACACGTGTTTCTCCCTGAATTGTGTCGCcgTLR-6TLR-6, sh3dir15’-phosphogatccgCACCAGAGGTCCAACCTTATTCACGTGAATAAGGTTGGACCTCTGGTGtttttgTLR-6, sh3rev1785’-phosphoaattcaaaaaCACCAGAGGTCCAACCTTATTCACGTGAATAAGGTTGGACCTCTGGTGcgОлигонуклеотиды попарно отжигались, а затем были заклонированы влентевирусный плазмидный вектор pLSLP по соответствующим сайтамрестрикцииДля получения рекомбинантного лентивируса использовали клеткиHEK293T,которыекотрансфецировалисьплазмидамиpRSV-Rev,pMDLg/pRRE (ген/вставка HIV-1 GAG/POL) (плазмида № 12251), pCeruleanVSVG (плазмида № 11913) и плазмидой, несущей shRNA гена интереса.Для проведения трансфекции клетки HEK293T культивировали на 90см чашке Петри до плотности пересева 50–70% со средой DMEM,содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), сыворотку(Sigma-Aldrich, F2442) и антибиотики (пеницилин и стрептомицин).
Послечего клетки промывали 1×PBS и наносили на них трансфекционную смесь:упаковочные плазмиды с целевой, на одну точку – 4 µg pRSV-Rev, 2 µgpMDLg/pRRE, 1 µg pCerulean-VSVG, 1,3 µg плазмиды интереса. Добавлялисмесь 150 µl OPTIMEM с 3 µl Plus Reagent. Через 5 минут добавляли смесь150 µl OPTIMEM с 6 µl липофектамина. Все перемешивания производилипосредствомплавногопипетирования.Инкубацияприкомнатнойтемпературе 40–50 минут.Инкубировали 6 часов в СО2-инкубаторе, затем клетки промывали 1хPBS, а среду заменяли свежей – DMEM и FBS до 5%. Первый вирусныйсупернатант собирали через 24 часа и фильтровали через фильтр-насадку спроницаемостью пор 0,45 микрона в пробирки. Клетки вновь заливалисвежей средой с добавлением 2% сыворотки по объему.
В дальнейшем сборвирусного супернатанта проводили несколько раз с интервалом 12 часов.Супернатантыобъединяли.Осаждениевирионовпроводилис12%полиэтиленгликолем при 4 °С 12 часов, центрифугировали при 5000 об/мин.79Очищенные супернатанты хранили либо на льду (не более часа), либо вкельвинаторе (при температуре –70 °С).Заражение и селекцию клеток RAW 264.7 проводили следующимобразом. Наращивали нативные клетки до 60–80% плотности пересева.Вирусные стоки объединяли (все по BFP, все по CLEC7A и т.д.). Добавляли 1мл вирусного концентрата с титром 108/мл, разведенного сывороткой 1:2, начашкис посеянными клетками. Добавляли полибрендоконечнойконцентрации 5 мкг/мл.
Инкубировали в CO2 инкубаторе двое суток. Затемклетки рассаживали с добавлением среды и добавляли пуромицин (SigmaAldrich, P9620) через сутки до концентрации 1 мкг/мл. Инкубировали клеткив инкубаторе сутки. Меняли среду и добавляли пуромицин – 2 мкг/мл.Селекцию вели 1–2 недели или до вымирания контроля. Выросшие до 60–80% плотности пересева, отселекционированные колонии отбирали ивысевали на пластик. Проверку выключения рецепторов проводили посвечению метки в генном конструкте RFP, GFP и BFP (контрольныеплазмиды инкубировались параллельно с целевыми). Эффективностьлентивирусной трансфекции составляла около 80%. В дальнейшем клеткиактивировали с помощью LPS и HTLP и тестировали на выработку TNF-α.2.2.7.9.Посадка антител anti-TLR-6, anti-CR3, anti-Dectin-1 на клеткиRAW 264.7Клетки RAW 264.7 отмывали дважды FACS окрашивающим буфером(dPBS containing 1% FCS и 0,1% NaN3).
Супернатант отбирали и добавлялипервичные антитела anti-TLR-6, anti-CR3, anti-Dectin-1 (Novus NB100-56536,ebioscience 14-0112-85, biovision 3891-100, соответственно), разведенные всреде без добавления FBS, инкубировали с ними 30 минут при температуре 4°C без доступа света. Концентрации антител к CR3 – 1 мкг/мл, TLR-6 – 4мкг/мл и Dectin-1 – 4 мкг/мл [243]. В дальнейшем клетки активировали спомощью LPS и HTLP и тестировали на выработку TNF-α.802.2.7.10.Противовирусная активностьДля оценки противовирусной активности полисахарида использовалиэкспериментальую модель герпетического менингоэнцефалита мышей.Использовали ВПГ-1, штамм Клейман, полученный из лабораториимузейных штаммов ГУ НИИ вирусологии им.
Д.И. Ивановского РАМН. Титрвируса определяли на модели фибробластов эмбрионов кур и культуреклеток Vero. Инфицирование определяли по максимальному поражениюклеток монослоя фибробластов эмбрионов кур, поражение монослоя – 80–100% уже через 20 часов после заражения. Инфекционный титр вируса вкультуре клеток Vero составил 6,5–7,0 lgТЦД50/0,1 мл (ТЦД – тканеваяцитопатогенная доза). В тоже время в экспериментах in vitro привнутримозговом или внутрибрюшинном введении ВПГ-1 белым мышаммассой 8–10 г равнялся 5,5–6,0 lgЛД50/0,03 мл.
Максимальное поражениемонослоя клеток Vero (75–100%) наблюдалось уже через 18–20 ч послеинфицирования.Белых мышей, BALB/c – группы по 30 особей, 18–20 г – инфицироваливирусом Клеймана внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл c содержанием в дозе10ЛД50 и 100ЛД50. Референц-препаратом был выбран ацикловир.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
