Диссертация (1102418), страница 11
Текст из файла (страница 11)
На колонку наносят 10 µl 1% раствора образца. Стандарты,фракцию полисахарида, элюирующие растворы фильтруют через фильтр 0,45мкм (ацетат целлюлозы) и дегазируют. Элюирование проб проводят 0,1 MNa2HPO4 + 0,1 M NaCl pH 6,8 со скоростью потока 1 мл/мин и комнатнойтемпературе. Выход полисахаридов из колонки контролируют с помощьюкачественнойреакциипофенол-сернокислотномуметоду.Фракции,соответствующие отдельным пикам, объединяют, диализуют и лиофильновысушивают.Для калибровки колонки используют аналитические стандартыдекстранов для гель-проникающей хроматографии 670, 150, 80, 50 и 12 кДа иголубой декстран молекулярной массы – 1–2 МДа (Sigma-Aldrich). Каждыйиз этих стандартов наносят отдельно на колонку в количестве 1 мг/мл.64Строяткалибровочнуюкривуюзависимостиконстантыдоступности от логарифма молекулярного веса стандартов используяExcel 2010.
Рассчитывают по следующей формуле: = − 0, − 0где Vt – общий объем колонки; Vo – свободный объем колонки (обычнорассчитывается по выходу голубого декстрана); Ve – максимальное значениепика элюции изучаемого вещества.Растворы калибровочных соединений хроматографируют в указанныхусловиях и строят калибровочный график в координатах времени удержаниясоединения и логарифма величины его молекулярной массы. Молекулярнуюмассу (MМ) HTLP рассчитывают на основании калибровочной кривой:Log (MМ) = - 3.1086 + 1.8812 RT - 0.1103 RT2, где RT – время выхода.Полученныепослехроматографированияфракциисобирают,диализуют и лиофилизируют.Все работы по изучению структурных характеристик и биологическойактивности проводят именно с фракцией, прошедшей все этапы очистки, подназванием полисахарид из Helianthus tuberosus L.
(HTLP). О достаточнойоднородности и гомогенности полученного материала свидетельствовалтолько один единственный, симметричный, узкий пик на профиле элюцииЖХВД-ГПХ (рис.10).2.2.4. Физико-химические характеристики2.2.4.1.УФ-спектроскопияУФ-спектры поглощения HTLP регистрировали на спектрофотометреUV-1800 Shimadzu в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Спектрыснимались в диапазоне длин волн 190–1100 нм. Растворы образцовполисахаридовHTLPсконцентрацией1мг/млцентрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин.65передизмерениемИнфракрасная спектроскопия2.2.4.2.Для снятия ИК-спектров использовался прибор IRAffinity-1 FTIRSystem (Shimadzu Corporation, Токио, Япония) с приставкой полноговнутреннего отражения – ATR MIRacle-10 (Алмаз/ZnSe призмой) – (PIKETechnologies, Мэдисон, штат Висконсин, США), с разрешением 4 см–1. Вкачествеобразцаиспользовалисьтаблеткигомогенныхпорошковполисахарида. В ступку помещали навеску полисахарида и порошок KBr доконечной концентрации 1% KBr.
Истирают с использованием агатовогопестика 20 минут. Затем полученный порошок помещают в прессовуюкамеру и готовят таблетку с использованием ручного пресса. После чеготаблетки используют для измерения ИК-спектров. Разложение контура полосв спектре делали с использованием пакета ACDLabs/Spectrus послестандартнойпроцедурыATR-коррекциибазовойлинии.Спектрырегистрировались в диапазоне от 4000 до 400 см–1.ЯМР-спектроскопия2.2.4.3.Для ЯМР-анализа использовался Bruker Avance 400 ЯМР-спектрометр(Bruker Biospin Corp., Биллерика, Массачусетс, США).
1 мг веществарастворяли в 0,5 мл D2O (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США).После чего спектры 1H и13C снимали при помощи 5-мм трубки прикомнатной температуре. Для спектра13C частота составляла 100,62 МГц,ширина развертки 26042 Гц, время захвата – 0,315 секунд, количество точек –8200, последовательность импульсов – zgdc. Для спектра1H частотасоставляла 400 МГц, ширина развертки 4006 Гц, время захвата – 1,022секунд, количество точек – 4100, последовательность импульсов – zg30.2.2.5. Анализ моносахаридного составаДля проведения анализа моносахаридного состава 2 мг полисахаридарастворяют в 2 мл 2 М трифторуксусной кислоты в стеклянной пробирке.Отбирают 1 мл раствора и переносят в стеклянные ампулы.
Ампулызапаивают с использованием газовой горелки. Кислотный гидролиз66полисахаридов проводят в течение 1 часа, при температуре 117 °C. Позавершению гидролиза, ампулы остужают до комнатной температуры,вскрывают и досуха упаривают на роторном испарителе. Затем добавляют 2мл 96% этанола (квалификации VWR), растворяют и вновь упаривают нароторном испарителе. Процедуру повторяют дважды. Подготовленныйобразец растворяют в 1 мл элюента. Добавляют 0,1% раствор мальтитола.Центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут. Полученныйсупернатант отбирают, помещают в HPLC флаконы и хроматографируют. Наколонку наносят 10 μl раствора с использованием автосэмплера. Анализпроводят на хроматографе Prominence Series HPLC система (ShimadzuCorporation, Токио, Япония) с фотодиодным детектором и колонкой ShodexAsahipak NH2P-50 4E (4.6 mmID × 250 mmL), при условиях: 1 мл/мин поток,25% – 3% фосфорной кислоты, 75% – ацетонитрила, при температуре 50 °С.Исследуемыеобразцыанализируютпараллельносостандартнымиобразцами, содержащими GlcA, GalA, Rha, Ara, Man, Glc, Gal, Fuc, Xyl.2.2.6.
Обработка ферментамиПолисахаридные растворы 0,001, 0,01, 0,1 и 1,0 мг/мл обрабатываютлитиказой из Arthrobacter Luteus (Sigma-Aldrich, SRE0018), специфичной кβ-(1→3)-гликозидным связям и целлюлазой, специфичной к β-(1→4) и внекоторойстепеникβ-(1→3)-гликозиднойсвязи(SigmaAldrich,MFCD00081510) в соответствии с методикой Стоуна и Кларка [238].Целлюлаза из Aspergillus niger (Sigma-Aldrich, C1184) [1,4-(1,3:1,4)-βD-Glucan 4-глюканогидролаза] катализирует гидролиз эндо-1,4-бета-Dгликозиднойсвязивцеллюлозе,лихенане,глюканеячменя,ицеллогексаозе. Не расщепляет целлобиозу или р-нитрофенил-β-D-глюкозид.Реакционная смесь – 0,1 М цитрат-фосфатный буфер с рН=5,0 при 37 °С 2 ч.Литиказа из Arthrobacter Luteus гидролизует полимеры глюкозы с β(1→3)-типом связей. Реакция ставилась в 67 mM калий-фосфатном буферепри pH=7,5, 25 °C, в течение 30-ти мин.67Гидролитическое расщепление осуществляют при весовом отношенииполисахарида к ферменту, равном 100:1.Реакцию останавливают посредством прогрева реакционной смесипри 60 °C в течение 30-ти мин.
После чего проверяют наличиебиологическойактивностиуполисахаридныхраствороввмоделистимуляции антителообразующих клеток.2.2.7. Биологическая активность2.2.7.1.ПирогенностьПирогенность проверяется на здоровых кроликах обоего пола весом 2 ±0,5 кг. Кролики содержатся в отдельных клетках при комнатной температуре.За трое суток до опыта отбираются кролики со стабильным весом итемпературой,небольные.Измерениятемпературытелапроводятмедицинским ректальным термометром, предварительно откалиброванным,для этого его вводили в прямую кишку на глубину примерно 7 см, не менеечем на 5 минут до стабилизации показателей температуры.
Исходнаятемпература подопытного кролика должна быть в пределах 38,5–39,5 °С.Определение температуры проводят в отдельной комнате с постояннойтемпературой 18–22 °С, изолированной от шума. Подопытные животные неполучают корма за 12 часов до начала опыта.Подогретый до 37 °С раствор полисахарида в 0,9% NaCl вводят вконцентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл в ушную вену.
Растворпредварительно фильтруют через 0,2 мкм фильтр для обеспечениястерильности. Контрольным животным вводят стерильный 0,9% растворNaCl, объемом 10 мл на 1 кг веса кролика. На каждую точку экспериментаиспользуется 3 подопытных животных, введение рабочих растворовпроизводят в течение получаса после измерения исходной температуры.Дальнейший замер температуры производят 3 раза в час. Условиемнепирогенности является отсутствие повышения температуры у всех68подопытных животных более 0,6 °С при любом измерении температуры, асуммарного повышения температуры в группе – 1,4 °С.2.2.7.2.Стимуляция антителообразующих клетокВ эксперименте используют мышей F1(СВАхС57Вl/6) в количестве по 5мышей на 1 точку.В качестве антигена для иммунизации применяют эритроциты барана(ЭБ).
Эритроциты дефибринированной крови барана трижды отмывают,центрифугируя в 50-кратном объеме раствора Хенкса (ПанЭкоб, Р025п),затем ресуспендируют в том же растворе. Контрольным мышам вводят ЭБ2×106, а опытным, совместно, ЭБ 2×106 + 100 мкг/мышь полисахарида,внутрибрюшинно.Уровень иммунного ответа у мышей, иммунизированныхЭБ,определяют по количеству антителообразующих клеток (АОК), выявляемыхв селезенке методом Ерне (АОК/сел), на 4–5 сутки после иммунизации [239].К 375 мг агарозы приливают 50 мл однократного раствора Хенкса(ПанЭкоб, Р025п). Колбу закрывают ватной пробкой, помещают на 1 час вкипящуюводянуюбаню,равномернопомешиваядоисчезновениякристаллов.
При этом контролируют уровень рН – 6,9 ± 0,5. После доведениярН колбу еще раз на 5 минут помещают на водяную баню. Затем горячуюагарозу помещают в термостатируемую водяную баню при 47 °С на 10–15минут и добавляют отмытые ЭБ. Суспензию аккуратно перемешивают. На100 мл агарозы – 2,7 мл 20% по объему ЭБ (проверяют в камере Горяева). ЭБс агарозой разливают по 3 мл в пробирки, которые предварительнонагревают до 47 °C. Опыт ставят в 2 параллелях.Мышей забивают декапитацией, извлекают селезенки, помещают ихпулами в среду 199 (ПанЭко, C230п), из расчета 1 селезенка в 4 мл среды.Каждую клеточную суспензию готовят из пула селезенок, относящихся кодной экспериментальной группе. Для этого используют стеклянныйгомогенизатор с неплотно прилегающим стеклянным пестиком. Очень69осторожно выдавливают из капсулы клетки в среду.
Из гомогенизаторасуспензию переливают через капроновый фильтр в пробирку. По мереготовностиклеточныесуспензиипереносятвчашки,которыепредварительно нагревают на водяной бане до 50 °С.В пробирку с 3 мл агарозы с ЭБ, находящуюся при 47 °С добавляют100–200 мкл тщательно перемешанной клеточной суспензии, аккуратноперемешивают и тут же выливают в теплую чашку Петри d=8,5 см, при этомвручную покачивают до равномерного заполнения поверхности дна чашки.После чего открытую чашку до полного остывания помещают наравновесный столик.После остывания чашки закрывают крышками и помещают в термостатна 1,5 часа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
