Диссертация (1102418), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Рецептор позволяет эффективно активировать противогрибковыйTH-1-зависимый иммунитет и 17 различных ответов [230].На внутриклеточной части Dectin-1 расположен ITAM-подобный мотив–YXXXI/LX7YXXL,которыйнетребуетклассическогопутифосфорилирования. Однако может фосфорилироваться Src киназой тирозинрасположенный проксимально из-за чего образуются сайты связывания дляSyk киназ.
Для передачи сигнала требуется оба SH2 домена Syk идимеризация мономеров Dectin-1 [231]. В настоящее время известно, что этоодин из немногих рецепторов (обнаружено еще у CLEC-2 и CLEC-9A),способный осуществлять сигнальные функции посредством только Sykкиназы. Дальнейшая передача сигнала идет посредством адаптерных белковCARD9 и MAP киназ. Сигнальные каскады могут идти через PLCγ2/Ca2+, чтоприводиткактивацииPKCδ,контролирующейкальцинейрин/NFATкомплекс и инфламмасому ROS/NLRP3 и фосфорилирование CARD9BCL10-Malt1. В свою очередь, CARD9 может активировать NF-κB.
Вдополнение к этому Syk может активировать NIK киназу и ее сигнальныйпуть.КромеSyk-зависимогопутиурецепторасуществуетиSyk-независимый путь сигналиации, через DED мотив и Ras, ососредованно черезRaf-1, что приводит к передаче сигнала по неканоническому – NF-κBсигнальному пути, который, к примеру, регулирует фагоцитоз макрофагов.Нарисунке5изображенывнутриклеточныеактивируемые после лиганд-связывания Dectin-1.57сигнальныекаскады,Рисунок 5.
Dectin-1 внутриклеточные сигнальные пути [232].Можно считать, что для β-гликанов различных типов характерносвязывание с тремя основными рецепторами: CR3, точнее его CD11bкомпонент; TLR-6, который димеризуется с TLR-2; также с Dectin-1, которыйможно рассматривать в качестве основного рецептора для этой группымолекул. При этом такое связывание происходит по-разному, что приводит кразным биологическим ответам. Обобщенные механизмы связывания ипроцессирования β-глюканов макрофагами и гранулоцитами представленына рисунке 6. Макрофаги связываются с глюканами посредством Dectin-1рецептора с участием или без димера TLR-2/TLR-6, при этом крупныемолекулы интернализуются и фрагментируются на меньшие частицы,58которые высвобождаются и процессируются гранулоцитами, моноцитамиили другими макрофагами за счет рецептора CR3 [233].Рисунок 6.
Взаимодействие β-глюканов с макрофагами и гранулоцитами[165].Необходимы более сложные и по-настоящему функциональныеисследования in vitro и in vivo, позволящие выяснить молекулярные аспектывзаимодействия полисахаридов с клеточными системами. Использованиемутантныхштаммов,трансгенныеклетки,мышидефицитныепоспецифическим генам – все это дает возможность получить уникальнуюинформацию о том, как полисахариды могут модулировать иммунный ответ,с участием каких рецепторов и запуском каких внутриклеточных какскадов.Одно из таких перспективных направлений – выключение генов клеточныхрецепторов, отвечающих за определенные биологические функции вклеточных культурах, методом РНК-интерференции.Вместе с тем, мощности современных вычислительных систем ужепозволяют моделировать некоторые внутриклеточные процессы in silico иоценивать биофизические характеристики и развитие живых систем.
Однимиз наиболее важных клеточных событий является апоптоз, в силу нарушения59его регуляции при многих патологических состояниях: онкологических инейродегенеративных заболеваниях, ишемических повреждениях, вирусныхпоражениях и т.п. Другим важнейшим клеточным событием являетсяпролиферацияклеток,позволяющаяподдерживатьпопуляциюирегулировать многие органные процессы.Одним из наиболее перспективных методов анализа состояния иповедения клетки является биофизическое моделирование. В данной работебыл использован метод анализа клеточной системы как активной среды, чтообусловлено присутствием большого числа колебательных биологическихпроцессов внутри клетки. Клетка, в результате, рассматривается в качествебифуркационной системы, в соответствии с представлениями Ляпунова обуфуркационных процессах.602. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1.МатериалыДля выделения полисахаридов c молекулярной массой 1–2 МДа и иханализа был взят сорт Helianthus tuberosus L.
Все использованные клеточныекультуры были получены в ФГБУН ИМБ им. В.А. Энгельгардта.Экспериментальные лабораторные животные приобретены в питомнике«Андреевка» ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН.2.2.Методы2.2.1. Химические методы анализаКоличественноефенолсернокислотнымопределениеметодомпокарбогидратовДюбуа[234].проводятДляпостроениякалибровочной кривой используют D-глюкозу. Из стандартного раствораглюкозы – 1 мг/мл, методом разбавления, готовят серию растворов сконцентрациями от 10, 20, 40, 80 и 100 мкг/мл. Калибровочный графикстроилинаоснованииизмеренийсерийстандартныхрастворовиконтрольной пробы – 1,0 мл дистиллированной воды.
Для определенияконцентрации углеводов в полученных экстрактах и фракциях готовят рядразведений. К 1 мл исследуемого раствора добавляют 1 мл 5% растворафенола (Sigma-Aldrich, P5566, х.ч.), тщательно перемешивают на вортексе.Затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты (Sigma-Aldrich,339741), также быстро перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатнойтемпературе. Пробирки помещают на 15 мин в кипящую водяную баню,охлаждают и снимают показания оптической плотности при 488 нм наспектрофотометре UV-1800 Shimadzu.Дляколичественногоопределениябелка,входящеговсостависследуемого полисахарида, используют метод окрашивания белков пометоду Лоури [235].Приготовление реактивов: реактив А: 2% раствор Na2CO3 в 0,1 Нрастворе NaOH; реактив В: 0,5% раствор CuSO4 × 5 H2O в 1% цитрате натрия61(Na2C4H4O6); реактив С: готовят непосредственно перед определением, годен1 день.
Реактив С = 15 мл реактива А + 0,3 мл реактива В = 50:1.Для построения калибровочного графика используют стандарт –раствор овальбумина различной концентрации – 2,5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100мкг/мл, приготовленные из стандартного раствора объемом 1 мл. Контролемслужит дистиллированная вода – 1 мл, используемая для разведенияобразцов. Смешивают 0,4 мл калибровочного раствора (количество белка2,5–100 мкг) с 2,0 мл реактива С, перемешивают и оставляют на 10 минутпри комнатной температуре. Затем добавляют 0,2 мл реактива ФолинаЧокальтеу(Sigma-Aldrich,содержимоеF9252),пробиркитщательноперемешивают и выдерживают 30 минут. Измерения оптической плотностипроводят на спектрофотометре UV-1800 Shimadzu при длине волны 750 нм.Содержаниебелкависследуемыхфракцияхрассчитываютпокалибровочному графику.2.2.2. Экстракция и ультрафильтрация Helianthus tuberosus L.Клубни Helianthus tuberosus L.
промывают проточной водой и сушат навоздухе. Отделяют корковый слой клубней и измельчают электрическоймясорубкой. Измельченное сырье заливаютдистиллированной водойтемпературы 100 °С, постоянно перемешивая, в соотношении 1:1 (w:w).Оставляют экстракт на 4 часа при комнатной температуре без доступа света.После чего центрифугируют при 8000 g в течение 20 минут для удалениянерастворимых частиц [236]. Супернатант очищают и концентрируют наустановке SartoJet (Sartorius stedim biotech) против дистиллированной воды сотсечением веществ c молекулярной массой менее 300 кДа c использованиемфильтров Sartocon Slice Cassette (полиэтерсульфоновые). Высушиваютлиофильно с градиентом температуры 10 °С до –50 °С с использованиемлиофилизатора Virtis Advantage 2,0 BenchTop Freeze Dryer / Lyophilizer, SPScientific, США.62Ультрафильтрацию для обессоливания и концентрирования всехрабочих растворов проводят с учетом разведения их дистиллированнойводой до 10-6 по объему.2.2.3.
Хроматографическое фракционированиеФракцию с диапазоном молекулярных масс больше 300 кДа, послеультрафильтрации, растворяют в дистиллированной воде, центрифугируютпри 5000 g в течение 20 минут и наносят на колонку DEAE 650 S TSK (2,6 ×35 см) в количестве 0,5 г, уравновешенную водой. Для фракционированияполисахаридовиспользуютэлюциюдистиллированнойводой,споследующим ступенчатым повышением концентрации соли растворами 0,5М КСl, 1 М КСl и 2 М КСl при скорости потока 1,0 мл/мин. Детекциюпроводят при длинах волн 210 и 280 нм и используют кондуктометр. Каждуюфракцию проверяют по качественной реакции с фенолсерной кислотой истроят профиль элюции зависимости объема выхода фракции в мл отпоглощения при 490 нм.Полученные фракции обессоливают и концентрируют тангенциальнойультрафильтрацией в ячейке Минитан (Millipore) с отсечением веществ смолекулярной массой меньше 10 кДа используют фильтр 10 000 NMWL,лиофильно высушивают и тестируют на наличие адъювантной активности.Биологическая активность была обнаружена только у фракцииполисахаридов элюированных раствором 0,5 М KCl после ионообменникаDEAE 650, в связи с этим дальнейшие работы проводились именно с ней.Для разделения по молекулярным массам используют эксклюзионнуюжидкостную хроматографию с использованием хроматографа Acta Avant(General Electric).Фракцию 0,5 М KCl после ионообменника DEAE 650 S TSK загружаютв колонку XK 50/100 (5 × 100 см), упакованную Toyopearl HW 75 (SigmaAldrich 807469), уравновешенную 0,01 М трис-буфером pH 6,6, затемэлюируют тем же раствором со скоростью элюции 0,5 мл/мин.63Стандартную кривую зависимости логарифма молекулярной массы(ММ) относительно времени выхода строят с использованием декстранов Тсерии с известными молекулярными массами: Т-100, T-80, T-40, T-20, T-10 иголубым декстраном молекулярной массы – 1–2 МДа (Sigma-Aldrich).
Дляопределения общего объема колонки используют раствор глюкозы. Каждыйиз этих стандартов был отдельно нанесен в количестве 10 мг/мл.Детекцию проводят при длинах волн 210 и 280 нм, а также сиспользованием кондуктометра. Во фракциях определяют общее количествоуглеводов с помощью фенол сернокислотного метода и белков – методомЛоури.Молекулярнуюмассу(ММ)исследуемогополисахаридарассчитывают по декстрановой калибровочной кривой:Log (MW) = 5,0354 – 0,7553 Kav – 3,6489 Kav2, где Kav - коэффициентраспределения (отношение объемов неподвижной и подвижной фаз впределах хроматографической зоны) [237].ДляоценкимолекулярноймассыконечногопродуктаHTLPиспользуют система Prominence Series HPLC system (Shimadzu Corporation,Tokio, Japan) с фотодиодным детектором (детекцию проводят при 220 нм) иколонкой TSKG6000PW (7,5 × 300 mm) (Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart,Germany).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
