Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов (1102266), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Âñå ýêñïåðèìåíòàëüíûå èçìåðåíèÿ çîíäîâîé ìèêðîñêîïèè è ïîäãîòîâêà îáðàçöîâ ê ñêàíèðîâàíèþ âûïîëíåíû àâòîðîì ëè÷íî. Àíàëèç è èíòåðïðåòàöèÿ ýêñïåðèìåíòàëüíûõäàííûõ ïðîâåäåíû àâòîðîì ëè÷íî.Ýêñïåðèìåíòû ïî äèíàìè÷åñêîìó ñâåòîðàññåÿíèþ ïðîâåäåíû ñîâìåñòíî ñ Çàâüÿëîâîé Åëåíîé. Ìîäåëèðîâàíèå ìåòîäîì ÌÄ ïðîâåäåíî ñîâìåñòíî ñ Òîëñòîâîé Àííîé, Îôåðêèíûì Èãîðåì è Ãîäçè Ìàêñèìîì. Ýêñïåðèìåíòû ïî ôåðìåíòíîìó àíàëèçó ÄÍÏ è ÐÍÏ ïðîâåäåíû ñîâìåñòíî ñ Íèêèòèíûì Íèêîëàåì è Ïîëîçîâûì Âàñèëèåì.Ïóáëèêàöèè.
Ïî òåìå äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû îïóáëèêîâàíà21 ðàáîòà, â òîì ÷èñëå 7 ñòàòåé è 14 ïóáëèêàöèé â ñáîðíèêàõ òåçèñîâäîêëàäîâ êîíôåðåíöèé.Ñòðóêòóðà è îáúåì äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû. Äèññåðòàöèîííàÿ ðàáîòà ñîñòîèò èç ââåäåíèÿ, ÷åòûðåõ ãëàâ, çàêëþ÷åíèÿ, ñïèñêà ëèòåðàòóðû, âêëþ÷àþùåãî 126 íàèìåíîâàíèé. Ðàáîòà èçëîæåíàíà 134 ñòðàíèöàõ, ñîäåðæèò 69 ðèñóíêîâ è 6 òàáëèö.Îñíîâíîå ñîäåðæàíèå ðàáîòûÂî Ââåäåíèè èçëàãàåòñÿ àêòóàëüíîñòü âûáðàííîé òåìû äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû, îïðåäåëÿþòñÿ åå öåëè è çàäà÷è.Ãëàâà I äèññåðòàöèè ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îáçîð ëèòåðàòóðû èñîñòîèò èç ÷åòûðåõ ðàçäåëîâ.  ðàçäåëå I.1 îïèñûâàþòñÿ îñíîâíûå ìåòîäèêè ÀÑÌ, â ðàçäåëå I.2 ðàññêàçàíî îá îáùèõ îñîáåííîñòÿõ áåëîê-áåëêîâûõ âçàèìîäåéñòâèé.  ðàçäåëå I.3 îïèñûâàåòñÿ ñèñòåìà ñâåðòûâàíèÿ êðîâè, ïåðå÷èñëÿþòñÿ ñóùåñòâóþùèå ìîäåëè ìîëåêóëÿðíîé ñòðóêòóðû âîëîêîí, îáðàçîâàííûõ ôèáðèíîì.6Ïîäðîáíî îïèñàíû ðåçóëüòàòû ïðîâîäèâøèõñÿ ðàíåå ìèêðîñêîïè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé ðàííèõ âîëîêîí ôèáðèíà, îòäåëüíûõ ìîëåêóëôèáðèíà è ôèáðèíîãåíà.
 ðàçäåëå I.4 ñîäåðæàòñÿ áàçîâûå ñâåäåíèÿ î ñòðóêòóðå âèðóñíûõ ÷àñòèö, îïèñàíû èçâåñòíûå ýêñïåðèìåíòàëüíûå ðåçóëüòàòû ïî ñîçäàíèþ èñêóññòâåííûõ âèðóñîâ è ïîóïàêîâêå ÷óæåðîäíûõ ìàòåðèàëîâ (íóêëåèíîâûõ êèñëîò, ìåòàëëîâè äð.) â âèðóñíóþ îáîëî÷êó.Ãëàâà II äèññåðòàöèè ïðåäñòâëÿåò ñîáîé îïèñàíèå è àíàëèç ðåçóëüòàòîâ èññëåäîâàíèÿ ïðîöåññà àññîöèàöèè ôèáðèíà ïðè ñâåðòûâàíèè êðîâè.  ðàçäåëå II.1 îïèñûâàþòñÿ èñïîëüçîâàííûå â äàííîé÷àñòè ðàáîòû ìåòîäèêè: ìåòîäû ïðèãîòîâëåíèÿ îáðàçöîâ ôèáðèíîãåíà, ðàçðàáîòàííûå äëÿ íàáëþäåíèÿ îòäåëüíûõ ìîëåêóë, ìåòîäèêàîïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè òðîìáèíà, ðàçëè÷íûå ñïîñîáû ïðèãîòîâëåíèÿ îáðàçöîâ àññîöèàòîâ ôèáðèíà, èñïîëüçîâàâøèåñÿ ìåòîäû ñêàíèðîâàíèÿ. ðàçäåëàõ II.2, II.3 è II.4 îïèñûâàþòñÿ ðåçóëüòàòû ÀÑÌýêñïåðèìåíòîâ, ïðîâîäèòñÿ ñðàâíåíèå ýòèõ ðåçóëüòàòîâ ñ èçâåñòíûìè èç ëèòåðàòóðû äàííûìè ýêñïåðèìåíòîâ ïî ÏÝÌ. Íåñìîòðÿ íà òî÷òî èíòåíñèâíûå èññëåäîâàíèÿ ïðîöåññà ñâåðòûâàíèÿ êðîâè âåäóòñÿ óæå áîëåå 50 ëåò, ìåõàíèçì àññîöèàöèè ôèáðèíà íà ìîëåêóëÿðíîì óðîâíå íå äî êîíöà ÿñåí.
Èìåþùèåñÿ äàííûå î ñòðóêòóðå âîëîêîí áûëè ïîëó÷åíû ãëàâíûì îáðàçîì ïðè ïîìîùè ÏÝÌ.  ñîîòâåòñòâèè ñ îáùåïðèíÿòîé ìîäåëüþ ñ÷èòàåòñÿ, ÷òî ýëåìåíòàðíûì àññîöèàòîì ôèáðèíà ÿâëÿåòñÿ äâóòÿæåâîé êîìïëåêñ ïðîòîôèáðèëëà(ðèñ. 1à).  ïðîòîôèáðèëëå êàæäûé öåíòðàëüíûé Å-äîìåí âçàèìîäåéñòâóåò ñ äâóìÿ êîíöåâûìè D-äîìåíàìè äâóõ ñîñåäíèõ ìîëåêóë. äàííîé ðàáîòå ïðåäïðèíÿòà ïîïûòêà ïîëó÷èòü íîâûå ñâåäåíèÿ îñòðóêòóðå ïåðâè÷íûõ àññîöèàòîâ ôèáðèíà, äëÿ ýòîãî ïðèìåíÿåòñÿäðóãîé ìèêðîñêîïè÷åñêèé ìåòîä ÀÑÌ.  ðåçóëüòàòå îáíàðóæåíàëüòåðíàòèâíûé, âîçìîæíî ïàòîëîãè÷åñêèé, ñïîñîá ôîðìèðîâàíèÿòîíêèõ ïåðâè÷íûõ àññîöèàòîâ ïðîôèáðèëë (ðèñ.
1á).7Ðèñ. 1: Ñõåìû îáðàçîâàíèÿ àññîöèàòîâ ôèáðèíà: à) ïðîòîôèáðèëëá) ïðîôèáðèëë.Èç ëèòåðàòóðíûõ äàííûõ èçâåñòíî, ÷òî ñêîðîñòü ñîðáöèè ôèáðèíîãåíà íà ðàçëè÷íûå ïîäëîæêè ïðèìåðíî îäèíàêîâà, íî âëèÿíèåïîäëîæêè íà ñòðóêòóðó áåëêà ìîæåò áûòü î÷åíü ñèëüíûì. Èñõîäÿèç ýòîãî âñå ýêñïåðèìåíòû ïðîâîäèëè êàê íà ãèäðîôèëüíîé ñëþäå,òàê è íà ãèäðîôîáíûõ ÃÌÄÑ-ñëþäå è ÂÎÏÃ. Ñòàáèëüíåå âñåãî óäàâàëîñü âèçóàëèçèðîâàòü äîìåííóþ ñòðóêòóðó ôèáðèíîãåíà íà ïîâåðõíîñòè ñëþäû (ðèñ. 2).  õîäå ñîðáöèè íà ÂÎÏà è ÃÌÄÑ-ñëþäóìîëåêóëû ¾ðàñïëàñòûâàþòñÿ¿ ïî ïîâåðõíîñòè èç-çà âçàèìîäåéñòâèÿãèäðîôîáíûõ ó÷àñòêîâ ïîâåðõíîñòè áåëêà ñ ïîäëîæêîé, êðîìå òîãî, íà ãðàôèòå ìîëåêóëû ñêëîííû ê ñïîíòàííîé àãðåãàöèè äðóã ñäðóãîì.Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî ó 20% ìîëåêóë ôèáðèíîãåíà íà ñëþäåïðè pH 7,5 âèçóàëèçèðóþòñÿ âñå òðè ãëîáóëÿðíûõ äîìåíà.
 òî âðåìÿ êàê 80% ìîëåêóë âûãëÿäÿò êàê äâóõäîìåííûå ¾ãàíòåëè¿. Íàðèñ. 2 ïîêàçàíû îáà òèïà ìîëåêóë, ïî óâåëè÷åííûì ôðàãìåíòàìÀÑÌ-èçîáðàæåíèé ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, êàê èìåííî ðàñïîëîæåíà íà ïîâåðõíîñòè òà èëè èíàÿ ìîëåêóëà (ðèñ. 2 À, Á, Å). Ñðåäíÿÿâûñîòà D-äîìåíîâ ñîñòàâèëà 2, 2 ± 0, 4 íì (ðàçìåð âûáîðêè N=600),E-äîìåíîâ 1, 3±0, 4 íì (N=150), ñðåäíÿÿ äëèíà ìîëåêóë 402±6 íì(N=150). Ðàññòîÿíèå ìåæäó D-äîìåíàìè îäíîé ìîëåêóëû 20 ± 4 íì(N=150). Èç èçîáðàæåíèé, ïðèâåäåííûõ íà ðèñóíêå, ÿñíî âèäíî,8Ðèñ. 2: ÀÑÌ-èçîáðàæåíèÿ ìîëåêóë ôèáðèíîãåíà íà ñëþäå (A, Á),ÃÌÄÑ-ñëþäå (Ã, Ä) è ÂÎÏà (Ç, È).
Íà ñõåìàõ Á, Ä è È ïðåäñòàâëåíî âîçìîæíîå ðàñïîëîæåíèå ìîëåêóë íà ïîâåðõíîñòè. Íà ãðàôèêàõ Å è Æ ïðåäñòàâëåíû õàðàêòåðíûå ïðîôèëè îòäåëüíûõ ìîëåêóëôèáðèíîãåíà íà ñëþäå, íà ðèñóíêå Å ðàçëè÷èìû âñå òðè äîìåíà, íàðèñóíêå Æ òîëüêî D-äîìåíû. Íà ãðàôèêàõ Ê è Ë ïðåäñòàâëåíûõàðàêòåðíûå ïðîôèëè îòäåëüíûõ ìîëåêóë ôèáðèíîãåíà íà ÃÌÄÑñëþäå (Ê) è íà ÂÎÏà (Ë).9÷òî E-äîìåí ÷åòêî ðàçëè÷èì òîëüêî ó ñàìûõ äëèííûõ ìîëåêóë, êîòîðûå ¾ðàñòÿíóòû¿ ïî ïîâåðõíîñòè.
Èçâåñòíî, ÷òî ó÷àñòêè àëüôàñïèðàëåé, ñîåäèíÿþùèå ãëîáóëÿðíûå äîìåíû ôèáðèíîãåíà, îáëàäàþò áîëüøîé ïîäâèæíîñòüþ. Áëàãîäàðÿ ýòîìó îíè ñïîñîáíû èçãèáàòüñÿ â õîäå ñîðáöèè íà ïîâåðõíîñòü è D-äîìåíû ìîãóò ïî-ðàçíîìóðàñïîëîæèòüñÿ äðóã îòíîñèòåëüíî äðóãà. Åñëè îíè ðàñïîëîæåíûáëèçêî, à ó÷àñòêè àëüôà-ñïèðàëåé ìåæäó íèìè ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé èçâèâàþùèåñÿ íèòè, òî èç-çà óøèðåíèÿ, âíîñèìîãî êàíòèëåâåðîì, öåíòðàëüíûé E-äîìåí îêàçûâàåòñÿ ïðàêòè÷åñêè íåðàçëè÷èì èâèçóàëèçèðóåòñÿ òîëüêî êàê ïåðåìû÷êà (ïîíèæåíèå ïðîôèëÿ ìåæäó äâóìÿ êîíöåâûìè D-äîìåíàìè).
Ýòèì æå îáúÿñíÿåòñÿ è áîëüøîé ðàçáðîñ â çíà÷åíèÿõ êîíòóðíûõ äëèí ìîëåêóë, îïðåäåëåííûõïî ÀÑÌ-èçîáðàæåíèÿì.Èçîáðàæåíèÿ, ïîëó÷åííûå ïðè pH 7,5 íà ïîâåðõíîñòè ÃÌÄÑñëþäû, ñóùåñòâåííî îòëè÷àþòñÿ. Òàêàÿ ïîâåðõíîñòü ãèäðîôîáíà, èáåëîê âçàèìîäåéñòâóåò ñ íåé èíà÷å, ÷åì ñ ãèäðîôèëüíîé ñëþäîé.Íà ïîëó÷åííûõ èçîáðàæåíèÿõ òðóäíî èäåíòèôèöèðîâàòü D- è Eäîìåíû, õîòÿ â îòäåëüíûõ ñëó÷àÿõ ýòî óäàåòñÿ (ðèñ. 2 Ã, Ä, Æ).Ñðåäíÿÿ âûñîòà D-äîìåíîâ íà ïîâåðõíîñòè ÃÌÄÑ-ñëþäû ñîñòàâèëà1, 2±0, 4 íì (N=100), ñðåäíÿÿ äëèíà îòäåëüíûõ ìîëåêóë 60±9 íì(N=30).Òðåòüÿ èç èñïîëüçîâàííûõ ïîäëîæåê ãðàôèò òàêæå ãèäðîôîáíàÿ. Âûñîòà D-äîìåíîâ íà íåì ñîñòàâèëà 1, 6 ± 0, 4 íì (N=200),ñðåäíÿÿ äëèíà îòäåëüíûõ ìîëåêóë 50 ± 11 íì (N=30). Íà ãðàôèòååùå òðóäíåå, ÷åì íà ÃÌÄÑ-ñëþäå, îïðåäåëèòü, êàê èìåííî ðàñïîëîæåíû äîìåíû ìîëåêóëû, íî èíîãäà ýòî ìîæíî ñäåëàòü.
Îòäåëüíîõî÷åòñÿ îòìåòèòü, ÷òî íà îáðàçöàõ, ïðèãîòîâëåííûõ íà ãðàôèòå, íåâñåãäà âîçìîæíî ðàññìîòðåòü îòäåëüíûå ìîëåêóëû, ïîñêîëüêó ÷àñòîìîëåêóëû àãðåãèðóþò ñ îáðàçîâàíèåì ïðîòÿæåííûõ àññîöèàòîâ (ñì.ðèñ. 2 Â). Àíàëîãè÷íîå ñèëüíîå âëèÿíèå ÂÎÏà íà ìîëåêóëû ôèáðèíîãåíà áûëî îòìå÷åíî â ðÿäå ðàáîò. Âñëåäñòâèå ýòîãî âñå ýêñïå10Ðèñ. 3: Äàííûå ìîäåëèðîâàíèÿ: À) íà÷àëüíàÿ êîíôîðìàöèÿ ìîëåêóëû íà ñëþäå; Á) íà÷àëüíàÿ êîíôîðìàöèÿ ìîëåêóëû íà ÃÌÄÑñëþäå; Â) êîíå÷íàÿ êîíôîðìàöèÿ ìîëåêóëû íà ñëþäå; Ã) êîíå÷íàÿêîíôîðìàöèÿ ìîëåêóëû íà ÃÌÄÑ-ñëþäå.ðèìåíòû ïî íàáëþäåíèþ àññîöèàöèè ôèáðèíà ïðîâîäèëè íà ñëþäåè äóáëèðîâàëè íà ñëþäå, ìîäèôèöèðîâàííîé ÃÌÄÑ.Äëÿ áîëåå ãëóáîêîãî ïîíèìàíèÿ ìåõàíèçìà ñîðáöèè áåëêà íàïîäëîæêè è äëÿ áîëåå äåòàëüíîé èíòåðïðåòàöèè äàííûõ ÀÑÌ áûëî ïðîâåäåíî ìîäåëèðîâàíèå ïðîöåññà ñîðáöèè ïðè ïîìîùè ìåòîäàÌÄ, â êîòîðîì âðåìåííàÿ ýâîëþöèÿ ñèñòåìû àòîìîâ îòñëåæèâàåòñÿïóòåì èíòåãðèðîâàíèÿ èõ óðàâíåíèé äâèæåíèÿ.
Ñèëû ìåæàòîìíîãîâçàèìîäåéñòâèÿ ïðåäñòàâëÿþòñÿ â êëàññè÷åñêîé ôîðìå êàê ãðàäèåíò ïîòåíöèàëüíîé ýíåðãèè ñèñòåìû. Äàííûé ìåòîä áûë èçíà÷àëüíîðàçðàáîòàí â òåîðåòè÷åñêîé ôèçèêå, íî ïîëó÷èë áîëüøîå ðàñïðîñòðàíåíèå â õèìèè è, íà÷èíàÿ ñ 80-õ ãîäîâ XX âåêà, â áèîôèçèêå.Îòïðàâíîé òî÷êîé â íàøåé ìîäåëè ÿâëÿåòñÿ êðèñòàëëè÷åñêàÿñòðóêòóðà ôèáðèíîãåíà, ïîëó÷åííàÿ ïóòåì ðåíòãåíîñòðóêòóðíîãîàíàëèçà è èìåþùàÿ ðàçðåøåíèå 2,90 A. Ñòðóêòóðà íàõîäèòñÿ â îòêðûòîì äîñòóïå â áàçå äàííûõ pdb-database ïîä èìåíåì 3GHG.Íà ðèñ. 3 èçîáðàæåíû íà÷àëüíûå è êîíå÷íûå êîíôîðìàöèè áåëêà, ïîëó÷åííûå â ìîäåëèðîâàíèè. Àäñîðáöèÿ ïðîèçîøëà â îáîèõñëó÷àÿõ, íî ñóùåñòâåííî ïî-ðàçíîìó íà ñëþäå è ÃÌÄÑ-ñëþäå.
Íàè11áîëåå ñóùåñòâåííûå ðàçëè÷èÿ íàáëþäàþòñÿ â îáëàñòÿõ ãëîáóëÿðíûõ D- è E-äîìåíîâ. Ëåãêî âèäåòü, ÷òî íà ïîâåðõíîñòè ãèäðîôîáíîéÃÌÄÑ-ñëþäû ãëîáóëÿðíûå äîìåíû áåëêà áîëåå ïëîòíî ïðèëåãàþòê ïîâåðõíîñòè ïîäëîæêè.  òî æå âðåìÿ, îáëàñòü àëüôà-ñïèðàëåéíà ÃÌÄÑ-ñëþäå îáðàçóåò ìåíüøå êîíòàêòîâ ñ ïîâåðõíîñòüþ, ÷åì íà÷èñòîé ñëþäå.Íàïðîòèâ, íà ñëþäå D-äîìåíû ¾îòòàëêèâàþòñÿ¿ îò ïîäëîæêè èíåïëîòíî ïðèìûêàþò ê íåé. Îáëàñòü Å-äîìåíà íå êàñàåòñÿ ïîäëîæêè.
Ó÷àñòêè àëüôà-ñïèðàëåé íà ñëþäå ïëîòíî ïðèìûêàþò ê ïîäëîæêå.Äëÿ òîãî ÷òîáû ñðàâíèòü ïîëó÷åííûå äàííûå ñ ÀÑÌ-èçîáðàæåíèÿìè, ðåçóëüòàòû ìîäåëèðîâàíèÿ óäîáíî ïðåäñòàâèòü â âèäå òîïîãðàôè÷åñêèõ êàðò. Äëÿ ýòîãî â ïëîñêîñòè XY âûáèðàëè óçëû ñåòêè ñ øàãîì 3 A è â êàæäîì óçëå îïðåäåëÿëè âûñîòó áåëêà íàäïîäëîæêîé. Ïîëó÷åííàÿ ñåòî÷íàÿ ôóíêöèÿ Z(X, Y ) ïðåäñòàâëÿåòñîáîé èäåàëüíóþ òîïîãðàôèþ àäñîðáèðîâàííîãî áåëêà è íå ÿâëÿåòñÿ ìîäåëüþ ÀÑÌ-èçîáðàæåíèÿ, ïîñêîëüêó íå ó÷èòûâàåò äåôîðìàöèé, ïðîèñõîäÿùèõ ïðè ñêàíèðîâàíèè.  ðåàëüíîì ýêñïåðèìåíòå èãëà îêàçûâàåò íà îáðàçåö ñèëüíîå âîçäåéñòâèå, è â ðåçóëüòàòåýòîãî âûñîòà áåëêà îêàçûâàåòñÿ çàíèæåíà. Äëÿ êîððåêòíîé ñèìóëÿöèè ïðîöåññà ñêàíèðîâàíèÿ íåîáõîäèìî ïðèìåíÿòü ìåòîäû ÌÄ èïðîèçâîäèòü ðàñ÷åòû íà âðåìåíà, êîòîðûå ñóùåñòâåííî ïðåâûøàþòâîçìîæíîñòè ñîâðåìåííûõ ñóïåðêîìïüþòåðîâ (ðåàëüíîå âðåìÿ âçàèìîäåéñòâèÿ èãëû ñ îáðàçöîì 10−6 ñ â êàæäîé òî÷êå èçîáðàæåíèÿ).Òåì íå ìåíåå, ñðàâíèâàòü ÀÑÌ-äàííûå ñ èäåàëüíîé òîïîãðàôèåéôèáðèíîãåíà óäîáíåå, ÷åì ñ ìîäåëüþ àòîìíîé ñòðóêòóðû.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
