Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов (1102266)
Текст из файла
На правах рукописиПРОТОПОПОВА Анна ДмитриевнаАТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯБИОМАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВСпециальность 02.00.06 ― высокомолекулярные соединенияАвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидатафизико-математических наукМосква – 2012Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристалловфизического факультета Московского Государственного Университета имениМ.В.Ломоносова.Научный руководитель:доктор физико-математических наукЯминский Игорь Владимирович.Официальные оппоненты:доктор физико-математических наукпрофессорШайтан Константин Вольдемарович,кандидат физико-математических наукВедущая организация:Клинов Дмитрий Владимирович.Институт общей физики имени А.М.Прохорова РАН.Защита состоится 13 февраля 2013 г в 17 час. 00 мин.
на заседаниидиссертационного совета Д 501.002.01 при Московском государственномуниверситете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва,Ленинские горы, д. 1, стр. 35, Центр коллективного пользования МГУ,конференц-зал.С диссертацией можно ознакомиться в Отделе диссертаций Научнойбиблиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова (Ломоносовский просп., д. 27).Автореферат разослан 28 декабря 2012 г.Ученый секретарьдиссертационного советакандидат физико-математических наукЛаптинская Т.
В.Îáùàÿ õàðàêòåðèñòèêà ðàáîòûÌèêðîñêîïè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ áèîìàêðîìîëåêóë áåëêîâ è íóêëåèíîâûõ êèñëîò ïðîâîäÿòñÿ, ãëàâíûì îáðàçîì, ìåòîäàìè ïðîñâå÷èâàþùåé ýëåêòðîííîé ìèêðîñêîïèè(ÏÝÌ) è ñêàíèðóþùåé çîíäîâîé ìèêðîñêîïèè (ÑÇÌ).  íàñòîÿùååâðåìÿ îáà ìåòîäà àêòèâíî ðàçâèâàþòñÿ, îïðåäåëÿþòñÿ íèøè ïðèìåíåíèÿ òîãî è äðóãîãî ýêñïåðèìåíòàëüíîãî ïîäõîäà.
Àòîìíî-ñèëîâàÿìèêðîñêîïèÿ (ÀÑÌ) ïðåèìóùåñòâåííî èñïîëüçóåòñÿ äëÿ èçó÷åíèÿïðîöåññîâ àäñîðáöèè âåùåñòâà íà ïîäëîæêè, íàïðèìåð äëÿ èññëåäîâàíèÿ àäñîðáöèè áåëêîâ, äëÿ ðàáîòû â æèäêèõ ñðåäàõ è ãàçàõ, äëÿèçó÷åíèÿ ìåõàíè÷åñêîé æåñòêîñòè áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòîâ è ïðîâåäåíèÿ ýêñïåðèìåíòîâ ïî ðàñòÿæåíèþ åäèíè÷íûõ ìîëåêóë ñèëîâîéñïåêòðîñêîïèè. Øèðîêèé ñïåêòð âîçìîæíîñòåé, ïðåäîñòàâëÿåìûõçîíäîâîé ìèêðîñêîïèåé äëÿ èçó÷åíèÿ áèîïîëèìåðîâ, îáóñëàâëèâàåòáîëüøîå êîëè÷åñòâî ðàáîò ïî ýòîé òåìàòèêå, ïóáëèêóåìûõ åæåãîäíîâ âåäóùèõ íàó÷íûõ æóðíàëàõ.Öåëü íàñòîÿùåé ðàáîòû ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêè äëÿ èññëåäîâàíèÿ ñ ïîìîùüþ ìåòîäà ÀÑÌ ñòðóêòóðû, ñâîéñòâ è îñîáåííîñòåé ïðîöåññà ôîðìèðîâàíèÿ áèîìàêðîìîëåêóëÿðíûõ êîìïëåêñîâíà ïðèìåðå äâóõ áèîëîãè÷åñêè çíà÷èìûõ ñèñòåì ñèñòåìû ñâåðòûâàíèÿ êðîâè è âèðóñíûõ ÷àñòèö.Ïåðâûé îáúåêò èññëåäîâàíèÿ áåëîê ôèáðèíîãåí, èãðàþùèéêëþ÷åâóþ ðîëü â ñâåðòûâàíèè êðîâè. Ïîä äåéñòâèåì òðîìáèíà îíïåðåõîäèò â àêòèâíóþ ôîðìó, íàçûâàåìóþ ôèáðèíîì, è àññîöèèðóåò, îáðàçóÿ êðóïíóþ ñåòü ìàêðîñêîïè÷åñêèõ âîëîêîí îñíîâóáóäóùåãî òðîìáà.
 íàñòîÿùåé ðàáîòå èññëåäîâàëàñü ìîëåêóëÿðíàÿñòðóêòóðà àññîöèàòîâ ôèáðèíà, îáðàçóþùèõñÿ íà ðàííèõ ñòàäèÿõðåàêöèè.Âòîðîé îáúåêò áåëîê îáîëî÷êè (ÁÎ) Õ âèðóñà êàðòîôåëÿ (ÕÂÊ).Èçâåñòíî, ÷òî â îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ ÁÎ ÕÂÊ ìîæåò îáðàçîâûâàòü ñïèðàëüíî-ñèììåòðè÷íóþ îáîëî÷êó âîêðóã ÐÍÊ.
 íàñòîÿùåéÀêòóàëüíîñòü ðàáîòû.1ðàáîòå èññëåäîâàëèñü ñòðóêòóðà, ñâîéñòâà è óñëîâèÿ ôîðìèðîâàíèÿêîìïëåêñîâ, îáðàçîâàííûõ ÁÎ ÕÂÊ ñ ÄÍÊ.Îñíîâíîå ðàçëè÷èå ìåæäó ýòèìè ñèñòåìàìè ñîñòîèò â òîì, ÷òîàññîöèàòû ôèáðèíà ýòî ÷èñòî áåëêîâûå ñòðóêòóðû, â òî âðåìÿêàê âèðóñíûå ÷àñòèöû ñòàáèëèçèðóþòñÿ íóêëåèíîâîé êèñëîòîé èÿâëÿþòñÿ áîëåå ñëîæíûì íóêëåîïðîòåèäíûì êîìïëåêñîì.Äëÿ äîñòèæåíèÿ öåëè áûëè ïîñòàâëåíû ñëåäóþùèå çàäà÷è:1. Ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêè äëÿ âèçóàëèçàöèè àññîöèàòîâ ôèáðèíà íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ ôîðìèðîâàíèÿ âîëîêîí è èññëåäîâàòüñòðóêòóðó ðàííèõ àññîöèàòîâ ôèáðèíà ìåòîäîì ÀÑÌ.2. Èññëåäîâàòü êîíôîðìàöèè ìîëåêóë ôèáðèíîãåíà, àäñîðáèðîâàííûõ íà ðàçëè÷íûå ïîäëîæêè ìåòîäàìè ÀÑÌ è ìîëåêóëÿðíîé äèíàìèêè (ÌÄ), ñîïîñòàâèòü ðåçóëüòàòû ìîäåëèðîâàíèÿñ ýêñïåðèìåíòàëüíûìè äàííûìè.3.
Èññëåäîâàòü óñëîâèÿ ôîðìèðîâàíèÿ è ñòðóêòóðó äåçîêñèðèáîíóêëåîïðîòåèäîâ (ÄÍÏ), ïîëó÷åííûõ in vitro íà îñíîâå ÁÎÕÂÊ è ÄÍÊ, ñðàâíèòü èõ ñòðóêòóðó ñ ðèáîíóêëåîïðîòåèäàìè(ÐÍÏ).4. Èññëåäîâàòü âîçìîæíîñòü ñîçäàíèÿ ÄÍÏ íà îñíîâå ÁÎ äðóãîãî ïîòåêñâèðóñà âèðóñà ìîçàèêè àëüòåðíàíòåðû (ÂÌÀëüò).5. Ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêó äëÿ àíàëèçà ìåõàíè÷åñêèõ ñâîéñòâ âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ñèëîâîãî êàðòèðîâàíèÿ (ÑÊ).ÀÑÌ-èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè íà ìèêðîñêîïàõ Nanoscope 3a (Digital Instruments, ÑØÀ) è Multimode 5(VEECO, ÑØÀ) â ðåçîíàíñíîì ðåæèìå íà âîçäóõå è â áóôåðíûõðàñòâîðàõ. Ïðè èçìåðåíèÿõ íà âîçäóõå èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûåêðåìíèåâûå êàíòèëåâåðû fpN01 (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 118190 êÃö,æåñòêîñòü 5,3 Í/ì è ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëûÌàòåðèàëû è ìåòîäû.225 íì, NT-MDT, Ðîññèÿ) è îñòðûå êàíòèëåâåðû fpN01S (ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû 10 íì, îñòàëüíûå ïàðàìåòðû òåæå).
Ïðè ñêàíèðîâàíèè â æèäêîñòè èñïîëüçîâàëè êàíòèëåâåðû SNL10 B (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 23 êÃö, æåñòêîñòü 0,12 Í/ì è ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû ìåíåå 12 íì, VEECO, ÑØÀ) èDNP-10 D (ðåçîíàíñíàÿ ÷àñòîòà 18 êÃö, ñðåäíÿÿ æåñòêîñòü 0,06 Í/ìè ãàðàíòèðîâàííûé ðàäèóñ çàêðóãëåíèÿ èãëû 20 íì, VEECO, ÑØÀ).Äëÿ îáðàáîòêè äàííûõ èñïîëüçîâàëè ïðîãðàììó ÔåìòîÑêàí Îíëàéí (ÖÏÒ, Ðîññèÿ).Ðàáîòà ïî èññëåäîâàíèþ ïðîöåññà ôîðìèðîâàíèÿ ôèáðèíîâîé ñåòè áûëà ïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé õèìèè ïðèðîäíûõ ñîåäèíåíèé õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Èñïîëüçîâàëè ðåêîìáèíàíòíûé÷åëîâå÷åñêèé òðîìáèí ñî ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ 3600 î.å./ìã(HTI, ÑØÀ), ÷åëîâå÷åñêèé òðîìáèí ñî ñòàíäàðòíîé àêòèâíîñòüþ110 î.å./ìë (NIBSC, Âåëèêîáðèòàíèÿ) è ÷åëîâå÷åñêèé ôèáðèíîãåí,âûäåëåííûé èç ïëàçìû êðîâè (Calbiochem, Ãåðìàíèÿ). Âñå ðåàêöèèïðîâîäèëè ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 27◦ C â áóôåðå, ñîñòîÿùåì èç20 ìM Òðèñ-àöåòàò, ðÍ 7,4, 0,14 Ì NaCl, 50 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl2 ,10 ìÌ CaCl2 . Ïåðåä êàæäûì ýêñïåðèìåíòîì ïî ôîðìèðîâàíèþ ôèáðèíîâîé ñåòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü òðîìáèíà, ïîñêîëüêó ýòîò ôåðìåíò î÷åíü ÷óâñòâèòåëåí ê öèêëàì çàìîðîçêè-ðàçìîðîçêè è åãî àêòèâíîñòü ìîæåò ñïîíòàííî ïàäàòü. Äëÿ ìîäèôèêàöèè ïîâåðõíîñòèñëþäû è ñòåêëà ïðè ñêàíèðîâàíèè â æèäêîñòè èñïîëüçîâàëè ãåêñàìåòèëäèñèëàçàí (ÃÌÄÑ, Sigma-Aldrich, ÑØÀ).Ðàáîòà ïî ìîäåëèðîâàíèþ àäñîðáöèè ôèáðèíîãåíà ìåòîäîì ÌÄáûëà ïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé áèîôèçèêè ôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Ìîäåëèðîâàíèå ñîðáöèè ïðîâîäèëè â ïðîãðàììåNAMD 2.7 áåñïëàòíîé ïðîãðàììå äëÿ ÌÄ, îáëàäàþùåé âûñîêîéýôôåêòèâíîñòüþ ðàñïàðàëëåëèâàíèÿ âû÷èñëåíèé è ÷àñòî ïðèìåíÿåìîé äëÿ ñèìóëÿöèè áîëüøèõ ñèñòåì, ñîñòîÿùèõ èç ìèëëèîíîâ àòîìîâ. Èñïîëüçîâàëè ñèëîâîå ïîëå CHARMM. Âñå âû÷èñëåíèÿ ïðîèç3âîäèëèñü íà ñóïåðêîìïüþòåðå Ëîìîíîñîâ, áûëè çàäåéñòâîâàíû 128âîñüìèÿäåðíûõ ïðîöåññîðîâ.Ðàáîòà ïî ðåêîíñòðóêöèè èñêóññòâåííûõ âèðóñíûõ ÷àñòèö áûëàïðîâåäåíà ñîâìåñòíî ñ êàôåäðîé âèðóñîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ.
Áûëè èñïîëüçîâàíû ÁÎ âèðóñîâ ÕÂÊ è ÂÌÀëüò,ÐÍÊ ÕÂÊ è âèðóñà òàáà÷íîé ìîçàèêè (ÂÒÌ), ÄÍÊ-êîïèÿ ÐÍÊÕÂÊ, âûäåëåííûå ïî ñòàíäàðòíûì ïðîòîêîëàì èç ñîîòâåòñòâóþùèõâèðóñíûõ ÷àñòèö.Íàó÷íàÿ íîâèçíà ðàáîòû.1. Ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà âèçóàëèçàöèè àññîöèàòîâ ôèáðèíà, îáðàçóþùèõñÿ íà íà÷àëüíîé ñòàäèè ñâåðòûâàíèÿ êðîâè. Âïåðâûåïîêàçàíî, ÷òî íàðÿäó ñ ïðîòîôèáðèëëàìè ñóùåñòâóþò áîëååòîíêèå àññîöèàòû ïðîôèáðèëëû, îáðàçîâàííûå ïðè ñâÿçûâàíèè α-Ñ äîìåíîâ ñîñåäíèõ ìîëåêóë äðóã ñ äðóãîì.2. Ïðîâåäåíî èññëåäîâàíèå ïðîöåññà ñîðáöèè ôèáðèíîãåíà íà ñëþäó è ñëþäó, ìîäèôèöèðîâàííóþ ÃÌÄÑ, ìåòîäàìè ÀÑÌ è ÌÄ.Ïîêàçàíî, ÷òî êîíôîðìàöèè ìîëåêóë íà ãèäðîôèëüíîé è ãèäðîôîáíîé ïîäëîæêàõ ñóùåñòâåííî ðàçëè÷àþòñÿ.3.
Ïîêàçàíà âîçìîæíîñòü ôîðìèðîâàíèÿ êîìïëåêñîâ ÁÎ ÕÂÊñ ÄÍÊ, ïîäîáðàíû îïòèìàëüíûå óñëîâèÿ äëÿ ôîðìèðîâàíèÿýòèõ ÍÏ. Ïîêàçàíî, ÷òî óêëàäêà áåëêà â ÄÍÏ ñóùåñòâåííîîòëè÷àåòñÿ îò ñòðóêòóðû îáîëî÷êè íàòèâíîãî âèðóñà è ÐÍÏ.Ïðåäïîëîæåíî, ÷òî ÁÎ ÕÂÊ ñâÿçûâàåòñÿ ñ ìàëîé áîðîçäêîéÄÍÊ.4. Ïîêàçàíî, ÷òî ïðè èñïîëüçîâàíèè ÁÎ äðóãîãî ïîòåêñâèðóñà ÂÌÀëüò ÄÍÏ íå îáðàçóþòñÿ. Âìåñòî ýòîãî ôîðìèðóþòñÿäëèííûå òÿæè àññîöèàòû ÁÎ, íå ñîäåðæàùèå ÄÍÊ.5. Ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà äëÿ àíàëèçà ìåõàíè÷åñêèõ ñâîéñòâ âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ÑÊ.4Ðåçóëüòàòû äèññåðòàöèèíîñÿò â ïåðâóþ î÷åðåäü ôóíäàìåíòàëüíûé õàðàêòåð.
Ïî ìíåíèþ àâòîðà, íàèáîëåå èíòåðåñíû òðè ðåçóëüòàòà: îáíàðóæåíèå òîíêèõ àññîöèàòîâ ôèáðèíà, â êîòîðûõ ìîëåêóëû áåëêà ñâÿçàííû, ïðåäïîëîæèòåëüíî, çà ñ÷åò âçàèìîäåéñòâèÿ α-C äîìåíîâ ñîñåäíèõ ìîëåêóë,îïðåäåëåíèå îñîáåííîñòåé ñòðóêòóðû ÄÍÏ è îïðåäåëåíèå æåñòêîñòè âèðóñíûõ ÷àñòèö ìåòîäîì ÑÊ.Âàæíûì ìåòîäîëîãè÷åñêèì ðåçóëüòàòîì äèññåðòàöèè ÿâëÿåòñÿðàçðàáîòàííûé àëãîðèòì äëÿ àíàëèçà äàííûõ ÑÊ. Ñèëîâîå êàðòèðîâàíèå âåñüìà òðóäîåìêèé ýêñïåðèìåíòàëüíûé ìåòîä, òðåáóþùèéñëîæíîãî àíàëèçà è èìåþùèé ñåðüåçíûå àðòåôàêòû, êîòîðûå ÷àñòîíå ó÷èòûâàþòñÿ ïðè îáðàáîòêå.
Íàñòîÿùàÿ ðàáîòà âíîñèò âêëàä âðàçâèòèå ýòîãî ìåòîäà.Àïðîáàöèÿ ðàáîòû. Îñíîâíûå ðåçóëüòàòû äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû äîêëàäûâàëèñü íà ñëåäóþùèõ íàó÷íûõ êîíôåðåíöèÿõ è øêîëàõ: 2nd International School on Surface Science ¾Technologies andMeasurements on Atomic Scale¿ 2012, Sochi, Russia; Øåñòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2012, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; Õ ÷òåíèÿ ïàìÿòè àêàäåìèêà Þ.À. Îâ÷èííèêîâà 2011, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; 17th International Biophysics Congress 2011, Beijing, China; 2nd International School ¾Nanomaterials andNanotechnologies in Living Systems. Safety and Nanomedicine¿ 2011,Moscow region, Russia; Ïÿòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2011, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; XXIIIçèìíÿÿ ìîëîäåæíàÿ íàó÷íàÿ øêîëà ¾Ïåðñïåêòèâíûå íàïðàâëåíèÿôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè¿ 2011, Ìîñêâà,Ðîññèÿ; ESF-EMBO Research Conference ¾Molecular Perspectives onProtein-Protein Interactions¿ 2010, Sant Feliu de Guixols, Spain;20th Anniversary Korea-Russia Science and Technology Forum 2010,Ìîñêâà, Ðîññèÿ; ×åòâåðòàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2010, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; ÒðåÏðàêòè÷åñêàÿ çíà÷èìîñòü ðàáîòû.5òüÿ ìåæäóíàðîäíàÿ êîíôåðåíöèÿ ¾Ñîâðåìåííûå äîñòèæåíèÿ áèîíàíîñêîïèè¿ 2009, Ìîñêâà, Ðîññèÿ; Ïåðâàÿ ìåæäóíàðîäíàÿ íàó÷íàÿ øêîëà ¾Íàíîìàòåðèàëû è íàíîòåõíîëîãèè â æèâûõ ñèñòåìàõ¿ 2009, Ðîññèÿ.Ëè÷íûé âêëàä àâòîðà.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
