Автореферат (1097909), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Было показано, что клеточныйрост наблюдается лишь в случае сверхтонких пленок толщиной 13 нм.Увеличение толщины покрытия до 30 нм приводило к полномуингибированию клеточного роста.термочувствительныхТакое явлениеграфт-полимеровнаосновеизвестно дляполи-N-ИПААм(Akiyama et al, 2004; Fukumori et al, 2010). Авторы не приводят объясненияданного феномена, но связывают зависимость роста клеток от толщины26покрытияразличной гидратируемостью ультратонких пленок, а такжеэффектом подлежащего субстрата.3.2 Бесферментное открепление клетокПроцессы открепления клеток в культуре от субстратов в отличиеот процессов клеточной адгезии до последнего времени не привлекали ксебе внимания. Недавно появились первые публикации, в которыхисследуются структурные и клеточные аспекты открепления клеток оттермочувствительныхподложек(Halperinпонижении температуры ниже НКТР.andKröger,2012)приЦелью данной части работыявлялось выявление закономерностей открепления клеток и клеточныхпластов от термочувствительных субстратов.Для открепления клетоктемпературу среды культивирования во всех экспериментах снижали до4 °С.Открепление клеток от термочувствительного покрытия происходитв результате набухания полимера.
При этом в случае линейных несшитыхполимеров происходит растворение и выход полимера в водную фазу.Отрыв клетки от субстрата неизменно сопровождается разрушениемцитоскелета и осфериванием клетки.Сравнительный анализ открепления клеток от покрытий на основеполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) с толщиной 5 мкм продемострировалзависимостьскоростиоткрепленияотгидрофобностисубстрата.Характерное время открепления клеток линии L929 составляло 0.5, 2.0, 30и 180 мин для полимеров с молярным отношением N-ИПААм и N-третБААм 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50 соответственно.
Скорость откреплениязависела не только от гидрофобности субстрата, но и от метода полученияпокрытия. Дляпокрытий на основе поли-N-ИПААм,полученныхметодом центрифугирования, характерное время открепления клеток, какправило, составляло 10 мин. Как и в случае традиционной трипсинизации27клеток,скорость открепления в сильной степенизависелаоттипаклеточной культуры. В таб. 4 приведены сравнительные характеристикиоткрепления 7-ми трансформированных клеточных линий.Таб. 4. Время открепления трансформированных линий клеток от покрытия наоснове поли-N-ИПААм.Время открепления,% открепившихсяклетокС330CaSkiSiHaA549HeLaSW480 HaCat5 мин60 мин5 мин5 мин10 мин5 мин5 мин100%30%100%100%100%100%100%При анализе процессов открепления клеток от термочувствительныхсубстратов целесообразно разделять открепление единичных клеток иклеточных пластов.
Механизм открепления клеточных пластов связан свнутреннимимеханическимилокальному отделениюнапряжениями,которыеприводяткпласта клеток, после чего пласт волнообразнооткрепляется от подложки.Отделившаяся часть пласта начинает«заворачиваться», как это показано на рис. 10 (а).Клетки в пластахфибробластов (рис. 10 (а)) сохраняют механическую связность за счетэлементов внеклеточного мактрикса, ноконтактов. В случае эндотелиальных клетокне за счет межклеточных(рис. 10 (б))клеточныеконтакты сохраняются и при откреплении клеточного пласта (Moran et al.,2007).Серия фотографии на рис.11 характеризует динамику открепленияклеточных пластов с ультратонкого гидрогеляна основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ).Нами было исследованооткрепления клеток.влияние факторов адгезии наскоростьДинамика открепления клеток линии 3Т3отпокрытия на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (мол.
отношение28Рис. 10. Открепление клеточных пластов при понижении температуры до 4°С.Сканирующая электронная микроскопия. а) Открепления пласта клеток линии 3Т3,культивируемых на сополимере поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (85/15) покрытомколлагеном. Открепление, как правило, начинается на границе.б) Полностьюоткрепившийся пласт первичных эндотелиальных клеток HUVEC с сохранившимисяклеточными контактами.Рис. 11. Открепления пласта клеток линии 3Т3, культивируемых на ультратонкихгидрогелях на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ). Клеточный пласт открепляясьзаворачивается на себя. Открепление пласта начинается через 5 мин послепонижения температуры до 4 0С и полностью заканчивается через 10 мин.
Толщинапокрытия - 13 нм. Шкала - 50 мкм.(85:15)), модифицированного ламинином (А) и коллагеном типа I (Б),приведена в таб. 5.Скорость открепления клеток от наиболее29гидрофильного сополимера (85/15) не зависела от белка, которыммодифицированы термочувствительные покрытия.Для сополимеров(65/35) и (50/50) скорость открепления клеток резко уменьшалась, приэтом динамика открепления зависела от типа ФА.Таб.
5. Процент открепившихся клеток от покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со-Nтрет-БААм), модифицированных коллагеном и ламинином.Поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм), 85/15Поли-(N-ИПААм-со-N-трет-Поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм),БААм),ЛамининКоллагенЛамининКоллагенЛамининКоллаген20 мин,100%20 мин,100%60 мин,95%60 мин,60%60 мин,75%60 мин,60%65/3550/503.3 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки человекана термочувствительных подложкахПрименение стволовых клеток – одно из основныхсовременнойрегенеративноймедицины.клеткинаправленийМультипотентныемезенхимальныестромальныедифференцировкев остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты(МСК)способныек(хрящевые клетки) и в адипоциты (жировые клетки) активно применяютсяв клеточной терапии и тканевой инженерии.применяемых в медицине,Культивирование МСК,должно соответствовать технологическим имедицинским стандартам.Одно из ограничений, налагаемых стандартами, связано с минимальнымприменением или отказом от продуктов животного происхождения, в томчисле протеолитических ферментов.развитие новых технологийТаким образом,необходимокультивирования стволовых клеток.
Цельюданной части работы являлась разработка методов культивирования МСКчеловекана покрытиях на основе поли-N-ИПААм. В соответствии сцелью исследования были определены следующие задачи:30- Определение фенотипа стволовых клеток в процессе культивирования,открепления и многократного пассирования клеток;- Определение режимов дифференцировки МСК.ПрианализефенотипадифференцировкимезенхимальнымМСКиопределениимаркеровмы придерживались рекомендаций комитета пои тканевымстволовым клеткам международногообщества клеточной терапии ( Mesenchymal and Tissue Stem CellCommittee of the International Society for Cellular Therapy (ISCT)) (Dominici,et al, 2006).
Возможное влияние полимеров и процедуры холодовогооткрепления наМСК исследовалось в экспериментах, в которыхпроцедура бесферментного открепления повторялась трижды. Покрытияполучали методом высушивания из раствора (толщина 1 мкм).Позитивные маркеры,бесферментногокак в случае трипсинизации, так и в случаеснятиянаблюдалисьуболееклеток,95%чтосоответствовало установленным критериям для МСК (таб.
6). Для«негативных» маркеров установленным критерием является порог в 2%.Этому критериюоткрепления, такудовлетворяли клеткикак после бесферментногои после трипсинизации. Данные по экспрессиимаркеров дифференцировки МСК свидетельствуют, что фенотип МСК неменяетсяприпролонгированномкультивированиинатермочувствительных материалах. В следующей группе экспериментовмыисследовалипроцессдифференцировкиклетоквостеоциты,хондроциты и адипоциты.Оценку степени дифференцировки адипоцитов оценивали по общемукальцию, адипоцитов - по окраске липидов, хондроцитов - по количествугликозоамингликанов (ГАГ) нормированных на общее количество ДНК вклеточной популяции.
Степень дифференцировки всех указанных типовклеток на термочувствительных покрытиях не отличалась от контрольной.Фотографии монослоев МСК, остеоцитов и адипоцитов приведены на31Таб. 6. Экспрессия маркеров после трипсинизации и трехкратного бесферментногоснятия клеток на покрытиях из поли-N-ИПААм (1 мкм).МаркерCD19 (-)CD34 (-)CD45 (-)CD73 (+)CD90 (+)CD105 (+)Трипсинизация (%)0.9±0.11.1±0.40.8±0.196.0±1.595.6±0.998.0±1.2поли-N-ИПААм (%)0.7±0.21.5±0.41.0±0.295.5±1.295.2±1.198.8±1.0рис.
12. Таким образом, впервые было показано, что покрытия на основеполи-N-ИПААм могут успешно использоваться длякультивированияМСК, а также для получения остеобластов, хондроцитов и адипоцитов.Рис. 12.Дифференцировка МСК в остеоциты (а) и адипоциты (б) натермочувствительном покрытии. Перед запуском дифференцировки клетки триждыпассировали на термочувствительном покрытии. (а) Дифференцировка МСК востеоциты.
Окраска ализарином красным. 1) Недифференцированные клетки.Снятие трипсином. 2) Недифференцированные клетки. Поли-N-ИПААм. 3)Дифференцировка на поли-N-ИПААм. 4) Дифференцировка. Снятие трипсином. (б)Дифференцировка МСК в адипоциты. 1) Недифференцированные клетки. Поли-NИПААм. 2) Недифференцированные клетки. Снятие трипсином. 3) Дифференцировкана поли-N-ИПААм. 4) Дифференцировка. Снятие трипсином.
(Шкала – 200 мкм).32Глава 4 посвящена проблеме доставки лекарств из термочувствительныхпокрытий на основе гидрогелей из поли-(N-ИПААм-со-ААБФ).4.1 Математическая модельДля описания процессов доставки лекарств из термочувствительныхпокрытий нами была предложена математическая модель, котораяописываетдиффузиюлекарстваизпленокприизменяющихсятемпературных режимах.
Концентрация родамина B в пленке мала, чтодает возможность использовать приближение слабых растворов ивоспользоваться законом Фика и уравнениями диффузии для переносавещества.Одномернаямодельнизкомолекулярныхс(x,t).описываетдинамикуконцентрациидиффундирующих молекул в полимерной пленкеМы предположили, чтопленка может находится в двухсостояниях. Коллапсированном, которое характеризуется толщиной Hc икоэффициентом диффузии D c ,и в набухшем, которое характеризуетсядругим набором параметров, толщиной H s и коэффициентом диффузии D s.Коллапсированное состояние соответствует системе с температурой вышеНКТР, а набухшее состояние – системе с температурой ниже НКТР.В момент t=0 пленка находится в коллапсированном состоянии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
