Автореферат (1097909), страница 3
Текст из файла (страница 3)
2. Параметры структурного перехода растворов поли-(N-ИПААм-со-N-третБААм),поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)иполи-(N-ИПААм-со-ААБФ).Данныедифференциальной сканирующей микрокалориметрии.поли-(N-ИПААм-соN-трет-БААм)поли-(N-ИПААм-соЕПМ))СодержаниеN-ИПААм, (%)100НКТР,°С32.9Т1/2,°С1.2∆Н, Дж/г8525.12.358.26516.13.566.6509.83.869.39033.82.342.78035.03.428.17035.64.021.46036.24.810.930.8*Поли-(N-ИПААм-со- 99ААБФ)*- Данные получены методом турбидиметрии.Сополимеры N-ИПААма в как с ЕПМ,50.61.5*так и с N-трет-БААмобладают большей Т1/2, что связано с уменьшением кооперативностиперехода. Наряду с НКТР полуширина перехода должна учитываться припроведении работ с клеточными культурами.Термочувствительные покрытияНами были разработаны покрытия на основелинейных сополимеровполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) и поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ), а такжегидрогель на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ).
Гидрогель получалипри помощи УФ-инициированнойфотореакции, которая обеспечивалаобразование полимерной термочувствительной сетки, а также ковалентноесвязывание с подлежащим полимерным субстратом, в нашем случае сПСКК. В качестве сшивающего агента использовали бензофенон. Схемафотореакции приведена в нашей работе (Nash et al., 2011).15В работе использовались два метода нанесения покрытий: методцентрифугированияцентрифугированияиметодвысушиванияизрастворов.Метод(“spin coating” или “spin cast” в англоязычнойлитературе) - один из наиболее эффективных способов получениягомогенных и «гладких» полимерных покрытий с толщинами в диапазоне10 нм - 10 мкм на плоских подложках.
Метод высушивания из растворапозволяет получать покрытия как на плоских подложках, так и в чашкахПетри и многолуночных плашках для культивирования клеток. Толщинапокрытий таких составляла 1-10 мкм. В сводной таб. 3 представленыпокрытия, которые использовались для бесферментного снятия клеток.Анализ элементного состава покрытий разных толщин, проведенныйметодом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии показал, чтосоотношение элементов С, N и О остается близким к стехиометрическому(75%,12.5%и12.5%соответственно)независимоотметодаприготовления покрытия.
Значения модуля Юнга для сухих покрытий,полученных методом наноиндентирования, находились в диапазоне 3-6ГПа, что соответствует значениям пластиков, применяемыхдлякультивирования клеток.Методомцентрифугирования были получены покрытияна основеполи-N-ИПААм, поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм), поли-(N-ИПААм-соЕПМ)иполи-(N-ИПААм-со-ААБФ).Намибылиполученыэкспериментальные зависимости толщины покрытия от угловой скоростивращенияh(ω),центрифугированияот концентрации полимера h(с) и от временидля различныхсополимеров, чтопозволилооптимизировать процесс формирования покрытий и получать покрытия сзаданной толщинойв диапазоне 10 нм - 2000 нм. RMS покрытий непревышало 15 нм.На рис. 4 приведены значения краевых углов смачивания для покрытий16Таб.
3.Термочувствительные покрытия, используемые для бесферментногооткрепления клеток.ПолимерыМетод полученияТолщинаполи-NИПААмЦентрифугированиеВысушиваниеизраствораЦентрифугированиеВысушиваниеизраствораЦентрифугирование30-2000 нм1-10 мкмполи-(NИПААм-со-Nтрет-БААм)Дополнительныехарактеристики100-1000 нм1-10 мкмМодификацияФА*10-100 нмПолимернаясетка (гель)Поли-(NИПААм-соААБФ)100 нмполи-(NЦентрифугированиеИПААм-EПM)*Факторы адгезии: коллаген I, ламинин I, фибронектин, поли-L-лизин.на основе сополимеров поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) иполи-(N-ИПААм-со-ЕПМ) ( толщина покрытий - 100 нм). Неожиданно низкимоказалось значение краевого угла для гомополимера поли-N-ИПААм (~50град.).
Это, безусловно, новый и важный результат, поскольку значениекраевой угла для поли-N-ИПААм оказывается в диапазоне значений,которые соответствуют цитосовместимым поверхностям. Существенно,что этот результат был подтвержден в более поздней работе (Coopersteinand Canavan, 2013).Краевые углы натеканиягелей на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ) былиопределены для ультратонких покрытий (13 нм) и для покрытий толщиной188 нм (рис.
4 (б)). Краевыеуглы покрытий столщинами 188 нмхарактеризуются поведением “Stick and slip”, т.е. залипанием (На рис. 4(б) выделен стрелкой) и отрывом фронта водной капли. Немонотоннаядинамика значений краевого угла, по-видимому, объясняется сорбциейводы сополимерами, что приводит к резкому уменьшению механических17Рис.4.Краевые углы смачивания для покрытий полученных методомцентрифугирования. а) Зависимость краевых углов от содержания поли-N-ИПААма.1) поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ) и2) поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм).Толщинапокрытий -100 нм. б) Краевые углы натекания покрытий из поли-(N-ИПААм-соААБФ). 1) Контроль – ПСКК; 2) поли-(N-ИПААм-со-ААБФ), толщина 13 нм, послеУФ-облучения ; 3) поли-(N-ИПААм-со-ААБФ), толщина 188 нм; после УФ-облучения.Стрелкой обозначен угол «налипания».характеристик покрытия.
В результате под действием вертикальнойсоставляющейповерхностногонатяженияна поверхности покрытияформируетсямикровыступ, который изменяет динамику движенияфронта капли на поверхности полимера. Сорбция воды в «гидрофобном»сколлапсированном состоянии поли-N-ИПААма составляет по нашимданным приблизительно 12 % от сухого веса покрытия, а для сополимерас молярным соотношением 50/50 – 4%.Эти результаты косвенноподтвердились в работах (Klymchenko et al., 2010, Chhabra et al, 2013), гдеисследовалось связывание воды при различной влажности газовой фазынад поверхностью покрытия из поли-N-ИПААма.Методом высушивания из раствора формировали покрытия на основеполи-N-ИПААм и поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм). Толщина покрытийсоставляла 1-10 мкм.
Методы формирования пленок приведены в работах(Gilcreest et al, 2004; Moran et al., 2007).Значения RMS для всехисследованных полимеров не превышали 30 нм, а в большинстве случаев18не превышали 10 нм. Значения краевых углов θ для сополимеровнаходились в диапазоне 74.5 град. для поли-N- ИПААм и 87.0 для полиN-трет-БААм. Значения поверхностной энергии сополимеров γ лежали вдипазоне 38.9 мДж/м2 и 31.0 мДж/м2 для поли-N-ИПААм и для поли-Nтрет-БААм соответственно (Gilcreest et al, 2004).(Расчет проведен вгруппе А.В. Горелова.) Краевые углы сополимеров поли-(N-ИПААм-соN-трет-БААм) также характеризовались поведением “Stick andslip”.Краевые углы покрытий с толщинами порядка нескольких микрон длягомополимеров и всех сополимеров лежали выше оптимальных значенийуглов, характерных для материалов, используемых при работе склеточнымикультурами.Последнееобстоятельствоприменение данного типа покрытий на основеосложняетполи-N-ИПААм приработе с клетками in vitro.Покрытия модифицированные факторами адгезии клетокОдним из основных методов улучшения цитосовместимости поверхностейявляется модификация поверхности факторами клеточной адгезии, какправило, белками.Белки должны равномерно покрывать подложку исохранять нативную структуру, позволяющую поддерживать адгезиюклеток.
В экспериментах с ФА были использованы сополимеры на основеполи-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм), полученные методом высушивания.Толщина термочувствительных покрытий составляла 4-5 мкм.Методынанесения ФА на полимерные покрытия изложены в (Moran et al., 2007).Коллаген типа Iна сополимере образовывал гетерогенные структуры наоснове неупорядоченных фибрил (рис.5). Нативность тройной спираликоллагена сохранялась, что подтверждает наличие повторяющейсяструктуры, характерной для коллагена, с периодом 67 нм. В отличие отколлагена, ламинин I и фибронектин однородно покрывали полимернуюподложку, сохраняя субъединичную структуру белков.19Рис. 5.Факторы адгезии на покрытии из поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)(молярное отношение 85/15).
Атомно-силовая микроскопия. (а) Коллаген I (RMS~51нм); (б) Ламинин I (RMS ~9 нм); (в) Фибронектин (RMS ~ 2.3 нм).Глава 3 посвящена взаимодействиюклеточных культуртермочувствительными покрытиями. Анализ такогосвзаимодействиявключает в себя два этапа. Прежде всего, необходимо было установитьосновныезакономерностиповерхностях,ростаклетокнатермочувствительныхпосле чего исследовать процессы бесферментногооткрепления клеток. Этим проблемам посвящены первые два параграфаданной главы.
В отдельном параграферассматривается поведение МСКчеловека на термочувствительных покрытиях. В экспериментах по ростуи бесферментному откреплению клеток нами было исследовано поведениеболее 15-ти типов первичных клеток и перевиваемых клеточных линий, ноанализ поведения стволовых клеток человека мы выделили в отдельныйпараграф, посколькуименно этот тип клетокявляется наиболееперспективным для использования в регенеративной медицине, тканевойинженерии и клеточной терапии.3.1 Рост клеток на термочувствительных покрытияхЗакономерности ростанаиболееподробноклетокбылиэпителиальных клеток HeLa.натермочувствительныхисследованыНа рис.наминасубстратахпримерелинии6 приведена численностьклеточной популяции на 1-й (N1) и 3-й (N3) день культивирования насополимерах поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) и в контроле на ПСКК.Число клеток в контроле значительно превышает количество клеток на20любом из сополимеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
