Автореферат (1097909), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Вместе с тем, относительный прирост клеток вконтролеи на сополимерах приблизительно совпадает (N3/N1).Интерпретируя эти данные в рамках логистической модели ростаклеточной популяции, можно заключить, что в случае полимерныхпокрытийнаблюдаетсязадержкаадгезииклеток,ноужеприкрепившиеся клетки входят в клеточный цикл. Из рис.6 также следует,чтос ростом содержания N-трет-БААм,количество клеток насополимерах увеличивается. Этот парадоксальный результат не можетбыть объяснен в рамках концепции «оптимальной смачиваемости»субстрата, т.к. увеличение содержания N-трет-БААм,делает системуболее гидрофобной и «отдаляет» от зоны оптимальных краевых углов,характерных для клеточной адгезии.Для объяснения механизмов адгезии и роста клеток нами былаисследованаэкспрессиягеновклетокHeLaнагомологичныхтермочувствительных покрытиях в сравнении с ПСКК.
Используя техникуДНК-чипов, были определены гены, экспрессия которыхотличнанавсехв клеткахпокрытиях поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)посравнению с контролем (рис.7 (в)). В списке детектированных геновможно выделить гены, непосредственносвязанные с внеклеточнымматриксом (фибронектин и тромбоспондин-1), с организацией цитоскелета(САР-1, α-актин), с митогенами (Smad6), с генами, контролирующимицитокины (ADAM17) и др. Экспрессия фибронектина в клетках, растущихна сополимерах, ниже, чем в контроле (уменьшение в -2.3-, 2.0-, и 2.6- разадлясополимеров50:50,65:35,85:15соответственно).тромбоспондина, гликопротеина внеклеточного матрикса,Дляуровеньэкспрессии снижен в 3.7, 5.4, 6.5 раза соответственно.
Резкое увеличениеэкспрессии гена DUSP2 (3.9, 14.6 и 17.0) связано в данном случаесорганизацией цитоскелета как показано в более поздних работах (Allen etal., 2006; SEFCIK et al, 2013). Для клеток, растущих на21полимерах,Клеток/лунку300,00024ч72ч200,000100,000012345Рис.
6. Рост клеток линии HeLa на сополимерах поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм). 1)поли-N-ИПААм; 2) Сополимер:85/15;3) Сополимер: 65/35;4) Сополимер:50/50;5) ПСКК.Толщина покрытий – 5 мкм. (Планки погрешностей соответствует стандартномуотклонению, n=3).наблюдается уменьшение экспрессии генов, связанных с организациеймикрофиламентов (TUBB4, TUBB, TUBA1 и α-актин), а также снижениеэкспрессии гена CAP-1, связанного с внутриклеточной концентрациейцАМФ и организацией микрофиламентов (в 1.8, в 1.8 и в 2.0 разасоответственно) .
Анализ экспрессии генов указывает как минимум на двесистемы, которые вовлечены в процесс прикрепления и распластыванияклеток, на внеклеточный матрикс и клеточный цитоскелет. Общая схемарегуляции клеточной адгезии, включающая вклады отдельных белков,сложна и недостаточно изучена, поэтому целесообразно было оценитьинтегральный параметр, характеризующий взаимодействие клеток стермочувствительнымипокрытиями.Площадьклеток,взаимодействующих с подложками, была определена с использованиемсистемы анализа изображений (рис.7 (а, б)).Средняя площадь клеток вконтроле значительно превышала площадь клеток на сополимерах, приэтом с увеличением содержания поли-N-ИПААм площадь клетокуменьшалась.Причина подобного поведения клеток была отчасти22объяснена в работе (Allen et al, 2006), где авторами на этой же группеполимеров поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) было показано, что сорбцияфибронектина – важнейшего фактора клеточной адгезии на поверхностисополимеровбыла меньше, чем в ПСКК, и уменьшаласьсодержания поли-N-ИПААм.следующую схемус ростомТаким образом, можно предположитьвзаимодействия клеток и термочувствительныхполимеров.
Фибронектин, присутствующий в среде культивирования,недостаточно адсорбируется на термочувствительные поверхности, что непозволяет клеткам распластаться, реорганизовать цитоскелет и войти вклеточный цикл. Поскольку в таких клеткахэлементов внеклеточного матрикса, тоснижен уровень синтезапроцесс рапластывания клетокеще более замедляется.Четкая зависимость роста клеток от содержания N-трет-БААмнаблюдалась также для линии клеток Hep2. Для линий клеток L929,BNHK-21, 3T3 и Vero рост клеток не зависел от композиции полимера,но был медленнее чем в контроле. Кроме того, для всех клеточных линийнаблюдалось достоверноеингибирование клеточного ростанагомополимере из поли-N-ИПААм.Гидрофобные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) необеспечиваютустойчивый рост клеток, следовательно необходимомодифицировать поверхность таких термочувствительных покрытийфакторами адгезии.
Данные по росту клеток на полимерах покрытыхколлагеном, ламинином и поли-L-лизином для клеток линии 3T3представленыускоряетна рис. 8.рост клеток,Очевидно, что нанесениеФА значительноно для каждого типа клеток и типа полимеранеобходимо подбирать оптимальный ФА.Так, для первичных клетокэндотелия HUVEC, культивируемых на сополимере 85/15, оптимальнымоказываются такие ФА как ламинин и коллаген. А для клеток 3Т3 –23Рис. 7. Клетки HeLa на термочувствительных покрытиях на основе поли-(N-ИПААмсо-N-трет-БААм).24 ч культивирования. Толщина покрытий – 5 мкм.а)Относительная площадь клеток на сополимерах по отношению к площади клеток наПСКК. Величина ошибки соответствует стандартной ошибке измерения.
В скобкахприведено количество измеренных клеток. Использованы следующие значения длядоверительных интервалов: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.005 при сравненииплощадей клеток на ПСКК и сополимерах по критерию Стьюдента .Обозначения (●)и (●●●) соответствуют значениям P<0.05 и P<0.005 при сравнении площадейклеток на различных сополимерах. б) Распластывание клеток на различныхсополимерах. Клетки на сополимере 85/15 при дальнейшем культивированииприобретают морфологию сходную с клетками на других сополимерах. Шкала – 50мкм. в) Экспрессия генов клеток HeLa, растущих на различных сополимерах.лучшие результаты были получены на сополимере 65/35 для этих же ФА, втоже время, поли-L-лизин недостаточно ускорял рост клеток.Поскольку краевой угол дляпленок изполи-N-ИПААм, полученныхметодом центрифугирования, составляет приблизительно 50 град., то241200КонтрольCollagenLaminin900ДНК (нг/мл)PLL600300C85/1565/3550/50Рис.
8. Рост клеток 3Т3 на термочувствительных покрытиях из поли-(N-ИПААм-соN-трет-БААм), модифицированных факторами адгезии. Группа колонок С, слеванаправо:ПСКК, ПСКК покрытый коллагеном, ламинином и поли-L-лизиномсоответственно. Группа колонок 85/15. Сополимер 85/15 без факторов адгезии,сополимер 85/15покрытый коллагеном, ламинином и поли-L-лизиномсоответственно. Для колонок 65/35 и 50/50 аналогично. Контроль – материалы безфакторов адгезии. Толщина покрытия – 4 мкм.
Общее количество ДНК определялосьпо методуPicoGreen. (Планки погрешностей соответствует стандартномуотклонению, n=3).можно предположить, что такое покрытие будет поддерживать ростклеток. Действительно, покрытие толщиной 100 нм из поли-N-ИПААм,полученноеобеспечиваетметодомростцентрифугирования,клеток,чемпокрытия,значительнополученныелучшеметодомвысушивания из раствора (рис.9). Рост клеток на покрытиях из поли-NИПААм, полученных методом центрифугирования,не зависел оттолщины покрытия во всем диапазоне толщин (10нм-103 нм), чтосвидетельствует о том, что метод нанесения покрытия является ключевымфактором при получении термочувствительных покрытий на основе полиN-ИПААм.Сходный результат получен и для сополимеров на основеполи-(N-ИПААм-со-ЕПМ).мономеровПри этом изменение соотношениясополимера не влияло на скорость роста клеток.
По-видимому, отсутствие концентрационной зависимости связано с тем, что25ДНК120%, К контролюМетаб.активность8040012345Рис. 9. Сравнение роста клеток 3Т3 на покрытиях, полученных методамицентрифугирования и высушивания из раствора. 1. ПСКК. 2. Покрытия на основеполи-N-ИПААм, полученные методом центрифугирования. Толщина -100 нм. 3.Покрытия на основе поли-N-ИПААм, полученные методом центрифугирования.Толщина - 812 нм.
4. Покрытия на основе поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ), полученныеметодом центрифугирования. Толщина -100 нм. Соотношение мономеров 60/40. 5.Покрытия на основе поли-N-ИПААм, полученные методом высушивания из раствора.Толщина -5 мкм. (Планки погрешностей соответствует стандартному отклонению,n=3).краевые углы всех сополимеров на основе поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ)находятся в диапазоне углов, характерных для адгезии клеток в культуре(20-50 град.).Следующимклассомтермочувствительныхметодом центрифугирования,поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)покрытий,полученныхбыли фотосшитые полимеры на основесотносительновысокимуровнемгидрофобности (краевой угол 80 град.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
