Диссертация (1097617), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Для облучения использовался волоконный лазер ЛАХТА-МИЛОН с длинойволны излучения 1,45 мкм и мощностью от 0,5 до 1,5 Вт. Такая длина волны была выбрана,чтобы исключить заметное лазерное воздействие на расположенную под суставным хрящомкостную ткань и избежать запуска репаративных процессов, связанных с активацией клетоккости и костного мозга. Излучение с длиной волны 1,45 мкм поглощается суставным хрящомв слое 0,4 мм [Баграташвили и др., 2006] и не достигает костной ткани. При облучениимыщелков в «макушках» (толщина хрящевой пластины достигает 2 мм) использоваласьдлина волны 1,56 мкм, проникающая на 1 мм, также не достигая костной ткани благодаряанатомическому строению сустава.В процессе лазерного воздействия с помощью сканирующего инфракрасноготепловизора ИРТИС-200 контролировалось изменение температуры в зоне облучения,которое для обеих длин волн не превышало 10° С.
При этом пространственная модуляциялазерного излучения обеспечивала градиенты температур порядка 100°С/см, а временнаямодуляция (импульсно-периодический характер лазерного воздействия) обеспечивалатермомеханическое воздействие с частотами 0,5-1,0 Гц.Гистологическое исследование облученных образцов показало отсутствиесущественных изменений структуры хрящевого матрикса, наблюдалось частичноеповреждение клеток только в центральной области пятен лазерного излучения при полномотсутствии каких либо видимых повреждений ткани в областях между лазерными пятнами,отстоящими друг от друга на расстояние 1-3 мм.130II этап: проводилось экспериментальное моделирование заболеваний коленныхсуставов задних конечностей минисвиней.
Проводили открытую артротомию коленногосустава в проекции внутренних мыщелков. Операции на суставах минисвиней проводилисьin vivo под общим наркозом в соответствии с международными нормами экспериментальныхисследований. С помощью специального хирургического инструмента (фреза и «скребок») внагружаемой при ходьбе зоне суставов создавались дефекты длиной 5-10 мм, шириной 2-4мм и глубиной 0,3-0,5 мм, что при толщине хрящевой пластины 0,7-1,1 мм обеспечивалоприповерхностное повреждение суставного хряща без повреждения костной ткани.
Такиедефекты моделировали травматическое повреждение суставов, которые никогда не заживаютсамостоятельно и впоследствии провоцируют возникновение артроза - дегенеративногозаболевания суставного хряща [Caplan et al., 1997]. Ускорение формированияэкспериментальной модели артроза было обеспечено благодаря механическойнестабильности сустава, получаемой путем дополнительного (во время операции)надсекания мениска в области его переднего рога.
Животные хорошо переносили операциюи вели нормальный образ жизни в течение двух месяцев.III этап: ранее оперированные суставы открывались (под общим наркозом), ипроизводилось их визуальное обследование. При вскрытии суставов наблюдали слабо илиумеренно выраженные признаки дегенеративных изменений синовиальной оболочки,утолщение фиброзной капсулы сустава, но без признаков воспаления. Экспериментальныетравматические дефекты четко выделялись на поверхности суставного хряща, их краявыглядели неровными и немного сглаженными, но во всех случаях размеры исходныхдефектов почти не менялись, то есть заметного зарастания дефектов не наблюдалось.
Крометого, в семи из 14 оперированных суставов вблизи первичных дефектов (Рис. 5.1) (нарасстоянии от 1 до 15 мм) в зонах наибольшей физиологической нагрузки наблюдалосьпоявление вторичных дефектов (Рис. 5.2), представлявших собой шершавую язвенноподобную приповерхностную зону неправильной формы размерами от 5 до 18 мм.У каждого животного один первичный и один вторичный дефект оставляли в качествеконтроля, а остальные дефекты облучали с помощью лазерных режимов, выбранных напервом этапе работы, при мощности излучения 0,6 Вт, длительности импульса 100 мс,частоте следования импульсов 1 Гц, диаметре лазерного пятна 0,6 мм и расстоянии междупятнами 1,5 - 2,5 мм.IV этап: через два месяца после лазерного облучения животные выводились изэксперимента, производилось вскрытие и визуальное обследование суставов, после чего131проводилось гистологическое исследование ткани, как облученных, так и контрольныхобразцов.Образцы ткани фиксировали в нейтральном 10%-ном формалине, заливали в парафин.Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ВанГизону для выявления коллагеновых волокон, толуидиновым синим для выявленияпротеогликанов.
Препараты исследовали и фотографировали с использованием световогомикроскопа OLYMPUS BX51, оснащенного цифровой видеокамерой Sanyo, при увеличенииот 40 х до 1000 х.Результаты и обсуждениеНеоблученные (контрольные) дефекты сохранились почти в прежних размерах,макроскопических признаков регенерации ткани не наблюдалось (Рис. 5.1). Пригистологическом исследовании в области первичных (хирургических) дефектов, неподвергавшихся лазерному воздействию, были обнаружены некротические идистрофические изменения суставного хряща.Рис.5.1.
Первичные дефекты в суставном хряще. Слева - сразу после лазерного облучения.Справа - через два месяца после лазерного облучения: нижний практически зарос новойтканью. Верхний - контроль (необлученный дефект) сохранил размеры.Вторичные дефекты (Рис. 5.2) суставного хряща, по данным гистологическогоисследования, представляли собой обширные участки суставной поверхности, в которыхотсутствовала блестящая пластинка, а сама хрящевая ткань состояла из мозаичнораспределенных областей с патологическими изменениями различной степенивыраженности. По данным гистологического исследования в части клеток хрящевой ткани132отмечались некроз или проявления дистрофии.
Выявлялись разрыхление, отек ифибриллизация матрикса (демаскировка части коллагеновых элементов, не визуализируемыхв интактном хряще), значительное снижение содержания протеогликанов.В целом, макроскопическая картина и результаты гистологического исследованиясвидетельствуют о том, что первичный хирургический дефект является адекватной модельютравматического повреждения суставного хряща. Вторичные дефекты сформировались врезультате патологического движения и механической нестабильности суставов.Совокупность изменений в области вторичных дефектов отражает дегенеративный процесс,аналогичный артрозу суставов человека.Рис.5.2.
Первичный (1) и вторичный (2) дефекты суставного хряща. Слева - через двамесяца после моделирования заболевания, в момент лазерного облучения. Справа - через двамесяца после лазерного облученияВсе (как первичные, так и вторичные) дефекты суставного хряща, подвергавшиесялазерному облучению, через два месяца почти полностью заросли плотной белесой(визуально хрящеподобной) тканью.Ниже приводятся результаты гистологического исследования одного из типичныхвторичных дефектов (Рис.5.3). Исходно (через два месяца после моделирования заболевания)длина дефекта составляла 12-14 мм, ширина - 6 мм; через два месяца после облучениядефект значительно уменьшился в размерах (длина и ширина оставшегося дефектасоставляли 4 и 1,5 мм).
Окружающий область дефекта интактный хрящ толщиной около 800мкм имел обычную структуру. В нем преобладали одиночные хондроциты, и около 1/3хондроцитов образовывали изогенные группы, состоящие из 2÷3 клеток. В центральнойчасти дефекта хрящевая пластинка истончена до 350-400 мкм, под ней неизмененная костная133ткань. В самом центре этой зоны (в области максимального лазерного воздействия) имеетсяузкий «столбик» ткани с некротизированными клетками. С обеих сторон «столбика» частьклеток в хрящевой ткани имеет признаки дистрофии, но появляются новообразованныехондроциты (хондробласты) с гипертрофированной цитоплазмой (признак активногобиосинтеза протеогликанов и коллагена матрикса хряща), а также изогенные группы (клоны)хондроцитов по 3 - 5 клеток в группе.
Такую картину можно расценить, как первые признакирегенерации.Рис. 5.3. Структура регенерирующей ткани на краю дефекта.Окраска гематоксилином и эозином, 400 х.В периферических областях дефекта толщина хрящевой пластинки была больше, чемв центре и составляла, в среднем, 540 мкм. Поверхность в этих участках более ровная. Общееколичество изогенных групп увеличивалось, как и количество клеток в них (от 5 до 17).Матрикс в этих участках был гомогенным и содержал такое же количество протеогликанов,как и интактный хрящ.
Регенеративный процесс в этих участках был выражен сильнее. Накраю бывшего дефекта на границе с интактной тканью наблюдалась зона восстановившейсяхрящевой ткани, в которой толщина хряща почти не отличалась от интактной. Матрикс вэтой зоне был гомогенным, богатым протеогликанами. Однако, количество клеток былозначительно больше (приблизительно в 3 раза); имелось много сравнительно мелкихизогенных групп (от 3 до 6 хондроцитов в группе); а сами хондроциты имели более крупныеразмеры, их цитоплазма была видна значительно более четко.
Указанные признакисвидетельствуют о высокой биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов(Рис. 5.3).134Таким образом, результаты гистологического исследования свидетельствуют о том,что лазерно-индуцированная регенерация хрящевой ткани при поверхностных дефектахпроисходит только за счет клеток самого хряща, а не за счет клеток костной ткани, костногомозга или фибробластов, присутствующих в синовиальной жидкости.
Истонченный хрящвыявляется только в узкой центральной части дефекта (там, где дефект виденмакроскопически). В остальной части дефекта наблюдается регенерация хрящевой ткани сформированием крупных изогенных групп хондроцитов вблизи центра зоны облучения, атакже мелких изогенных групп и активных хондроцитов на ее периферии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
