Диссертация (1097617), страница 25

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 25)

Уменьшениеразмеров видимого дефекта происходит за счет заполнения его регенерировавшей хрящевойтканью в направлении от краев дефекта к центру. Число активных одиночных хондроцитовувеличивается в направлении от центра к краям дефекта. Резкой границы междурегенерировавшей и интактной тканью нет, регенерат постепенно приобретает строениенормальной ткани.

Важно отметить, что, регенерация поверхностного дефекта происходитне путем замещения фиброзным хрящом, а путем роста гиалинового хряща (Рис. 5.3).В результате экспериментов было показано, что лазерно-индуцированная регенерацияхряща гиалинового типа через два месяца приводит к значительному восстановлениюхрящевой пластины сустава, что подтверждается гистологическими картинами суставногохряща после лазерного воздействия на первичный и вторичный дефекты на длинах волн 1,56мкм и 1,45 мкм (Рис. 5.4-5.7).Лазерное облучение λ=1,56 мкмРис.

5.4. Первичный дефект: Регенерация гиалинового хряща, который содержит типичныехондроциты с лакунами и большое количество кислых ГАГ в матриксе.Восстановление блестящей пластинки135Рис. 5.5. Вторичный дефект: Регенерация гиалинового хряща в глубоком полнослойномдефекте. Частичное восстановление блестящей пластинки.Окраска толуидиновым синим, × 200.Лазерное облучение λ=1,45 мкмРис. 5.6. Первичный дефект: Регенерация гиалинового хряща с большим количествомтипичные хондроцитов с лакунами и отдельными многоклеточными клонами.Восстановление архитектоники коллагена матрикса и блестящей пластинки.Окраска по Ван-Гизону на коллаген, × 400136Рис.

5.7. Вторичный дефект: В очень глубоком дефекте наблюдается регенерациягиалинового хряща и фиброзно-гиалинового хряща. Частичное восстановление блестящейпластинки. Окраска гематоксилином и эозином, × 100.В результате исследований было показано, что основные тканевые мишени лазерноговоздействия на хрящ:(1) Резидентные (местные) и костно-мозговые стволовые клетки: лазер вызываетстимуляцию пролиферации, дифференцировки, миграции, усиление синтезаспециализированного матрикса;(2) Резидентные зрелые клетки (хондроциты): лазер вызывает активацию синтезаспециализированного матрикса; и, возможно, частичную дедифференцировку (возвращаетспособность к делению);(3) Матрикс: лазер вызывает физико-химическую модификацию матрикса и создает«идеальное» микроокружение для клеток (запуск реакций пролиферации, миграции,дифференцировки, дедифференцировки, синтеза нового матрикса).Физические механизмы лазерной регенерацииНеоднородное импульсно-периодическое лазерное воздействие позволяет влиять напоследовательность дифференцировки и дедифференцировки клеток можно, за счеттермомеханического воздействия, создания пор, увеличения массопереноса сигнальныхмолекул..

Запустить эти процессы можно тремя путями:(1) Микропоры в хрящевом матриксе увеличивают гидропроницаемость матрикса, иобеспечивают дыхание хондроцитов и поступление к клеткам питательных веществ.137(2) Температурные градиенты увеличивают массоперенос в межклеточном матриксе иобеспечивают транспорт сигнальных молекул, запускающих процессы дифференцировкиклеток;(3) Лазерно-индуцированные газовые пузыри колеблются под действием импульснопериодического лазерного излучения, их динамические осцилляции с определенной частотойи амплитудой активируют пролиферацию и синтетическую активность хондроцитов(известно, что механическое воздействие на клетки с частотой примерно 1 Гц усиливаетсинтетическую активность клеток [Sobol et al., 2013].Процессы дифференцировки и дедифференцировки клетокОсновная идея изложенного здесь подхода состоит в том, что процессыдифференцировки и дедифференцировки клеток могут контролироваться воздействиемлазерного излучения на клетки путем модификации околоклеточного матрикса [Sobol et al.,2011].Процесс регенерации связан с естественными механизмами развития итрансформации клеток, начиная со стволовых клеток до хондроцитов разного типа [Sobol etal., 2011.

Эти процессы частично обратимы и управляются сигнальными молекулами имеханическими факторами. Процессы дифференцировки и дедифференцировки клетокпредставлены схематически на Рис. 5.8: №1 - мезенхимальные стволовые клетки; №2 - прехондроциты; №3 - незрелые хондроциты (хондробласты); №4 - многоядерные клоны - новыемолодые клетки, растущие в одной оболочке; №5 - гипертрофированные хондроциты; №6 хондроциты фиброзного хряща; №7 - хондроциты гиалинового хряща; №8 - путьдифференцировки; №9 - путь дедифференцировки; №10 - дополнительные пути клеточнойдифференцировки.138Рис.

5.8. Процессы дифференцировки и дедифференцировки клеток(описание в тексте) [Sobol et al., 2011].Схематическое изображение процесса управляемой регенерации под действиемлазерного излучения, включающая основные тканевые мишени, механизмы и результатылазерного воздействия приведено на Рис.

5.9.Рис. 5.9. Схематическое изображение процессауправляемой лазерно-индуцированной регенерации) [Sobol et al., 2011].139Микроскопия структурированного облучения с высоким разрешением. Подтвердиларост пор в матриксе суставного хряща под действием лазерного излучения с длиной волны1.56 мкм (Рис. 5.10) Представленная динамика хорошо согласуется с моделью роста пор,представленной в Главе 3 (Рис. 3.17)Рис. 5.10.

(а) интактный суставной хрящ; после лазерного воздействия (б) под местомоблучения и (в) в месте наибольших напряжений, ширина всех кадров 10 мкм.Электронные микрофотографии территориального матрикса в облученном хрящепредставлены на Рис. 5.11:Рис. 5.11. Просвечивающая электронная микроскопия: видна электронно-прозрачнаяобласть между клеткой и матриксом, в ней присутствуют сферические элементы,напоминающие газовые пузыри. Чтобы увидеть отдельные поры и пузырьки был сделансупертонкий срез 50 нм.Показано, что основные лазерно-индуцированные изменения структуры матрикса дляисследуемых лазерных параметров происходят в непосредственной близости к хондроцитам,в территориальном матриксе и проявляются в увеличении его электронной прозрачности и140образовании сферических пустот - газовых пузырьков. Показано (см. Главу 6), чтосущественную роль в стабилизации лазерно-индуцированной модификации структурыреберного хряща, склеры глаза играют газовые нанопузырьки, образующиеся принебольшом лазерном нагреве вследствие температурной зависимости растворимости газов.5.2.

Изготовление диагностических матриц для определения типа новообразованнойткани. Эффективность поверхностного лазерного наплавления трехкомпонентнойсреды с сохранением функциональности легкоплавкой составляющейНеобходимость проведения большого количества однотипных анализов иисследований на малом объеме материала привела к созданию диагностических матриц, воснову действия которых положен принцип одновременности проведения нескольких тестови объединение множества аналогичных тест-систем на одном носителе [Angenedt, 2005].Важность рассматриваемого в данном параграфе исследования и его связь с общей линиейдиссертационной работой обусловлена тем, что диагностика (особенно ранняя диагностика)типа новообразованной ткани при регенерации биологических тканей (рассмотренной в §5.1)остается одной из важнейших и не решенных до конца задач биоинженерии и биофизики.Для решения этой задачи могут быть эффективно использованы диагностические матрицы,взаимодействующие с биологическими тканями, а достаточно высокую плотностьрасположения чувствительных элементов можно обеспечить с использованием лазерногонаплавления среды, содержащей чувствительные элементы, на подложку.Как правило, диагностическая матрица представляет собой твердую подложку снанесенными в определенных областях чувствительными элементами, способными вступатьв реакции с веществами анализируемого образца.На настоящий момент существуют три основных типа диагностических матриц:белковые, клеточные и ДНК-биочипы.

Впервые связывание клеток с иммобилизированнымиантителами на биочипе произвел Т. Чанг (1983) [Chang, 1983]. В 2000 году МакБит иШрайбер создали первый белковый биочип [MacBeath et al., 2000]. Объединённый в биочипнабор различных ДНК был создан и применен для определения особенностей регуляцииэкспрессии генов интерферонами в 1987 году [Kulesh et al., 1987], а полный эукариотическийгеном был размещён на микрочипе в 1997 году [Lashkar et al., 1997.Существующие на сегодняшний день биочипы подразделяются на два класса [Variousauthors 1999]: микроматрицы различных соединений, в основном - биополимеров,иммобилизованных на поверхности подложки, или миниатюризованные микролаборатории.141Существенный вклад в развитие микрочипов внесли T.W.

Chang [Chang, 1983] А.Д.Мирзабеков [Vasiliskov et al., 1999; Bavykin et al., 1997; Chechetkin et al., 2000] и R. Ekins[Elkins et al., 1967; Elkins, 1987; Elkins et al., 1998], которые показали, что размерыаналитической системы в иммунологии могут быть уменьшены без потеричувствительности. Белки различаются друг от друга по биохимическим свойствам и встаетвопрос, как связать одинаковое количество разных белков на одной подложке, тем более, чтонекоторым белкам требуется специфическая подложка [Schirwitz, 2013], дополнительнуюсложность вызывает также то, что при иммобилизации структура белка может изменяться.Таким образом, основной проблемой при создании диагностических матриц являетсякомпактное расположение чувствительных комплексов на подложке.В настоящее время для белковых диагностических матриц плотность не превышает1000 чувствительных комплексов на туже площадь. На настоящий момент временисуществует 2 основные технологии создания диагностических матриц: (1) для матричныхбиочипов на специально подобранную подложку по секторам распределяют необходимыебелки, при этом прикрепление к подложке производится обычно путем нагрева (антитело,диффундирует из оболочки в подложку) или адсорбции; (2) для гелевых биочипов поверхподложки наносятся гелевые капли, и уже в них иммобилизируются антитела.Преимуществами второй технологии являются большая сохранность антител в геле ивозможность на порядок увеличить количество вносимых антител, а также использованиебольших специфичных биологических структур.

Характеристики

Список файлов диссертации