Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме. Под ред. Дж. Киршвинка. Том 1 (1989) (1095847), страница 55

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 55)

Срезы толщиной 3 мкм, изготовленные прк помощи микротома )3-4, помещали для разглаживания на поверхность воды в водяную баню„переносили на предметные стекла, высушивали и обрабатывали соответствующим образом. Если ткань была предварительно окрашена, то срезы можно было накрывать покровкымя стекламк и ЛдкаА!!зщил граиг.!!!р!!ых !!к,л!ачп!!ии же.!а;и! а к!!еу!!как начинать их исследование.

Если ткань не была окрашена, то производили следукядйе операций, Срезы нагревали до 60 С н вновь смачивали погружением В горячую дистиллированную воду. Эта процедура необходлма, поскольку прн окрвшиваний применяли стеклянные штативы, которые для предотвращения растрескйвания следовало нагревать перед помещением в горячий красящий раствор. Стекла с препаратами обрабатывали в течение 15 мин свежеприготовленным горячим кислым раствором ферроцианида кали», затем промывали дистиллированной иолой и подкрашивали койтрастируюшим красителем Кернехтрота Он состоит из 5%-ного раствора ядерного быстрого красного в дистиллированной воде, Срезы обрабатывали красителем в течение 30 мйи при 60'С, промывали дистиллированной водой.

Обезвожяваяи сначала в серии спиртов, а затем в кснлолс и закрывали покровиым стеклом, При наблюдении в световой микроскоп ткань благодаря контрастирующему крвсйтсяю Выглядит красной, а вклзочеикя железа-интенсивно синими, Если все операции проводят очень тщательно (используют бплистиллят, очищают все стекла, сосуды для окрашйванкя н т.д,), то поверхностных артефактов мало, Поскольку железо-широко распростракенный элемент и у позвоночных оио участвует в дыхании, его зышяение в данной ткана еще йе озйачает, «то оно в~е~д~ в ней ймеется. Очсвйдно„если железо у«зствует В сенсориОм процессе, ТО Оно дОлжнО всегда присутствовать в магииторецепторкой системе.

Исходя йз этого, мы установили следующий критерий положнтсльного окрашиваийя на железо. Окрашивание должно обнаруживаться в одийх и тех же клетках, по крайней мере в десяти последовательных срезах! и в одних и тех же клетках определенной ткани-по меньшей мере у пяти различных животных.

Позитивное окрашнвание нри использовании этой методики не доказывает, что обнаружен магнетит„но оно свидетельствует о присутствии железа к его локализации в ткани Железо. связапйое с бслкамя, например в гемоглобкне или цнтохромиых ферментах! никогда ве окрашивается. ЗТОт ВывОд был сделан при попытке Окрасить зритро питы голубя клк митохондрии в исследуемых тканях, Частицы магнетита окрашиваются .гак же, как и любые сплавы металлического железа, поэтому в процессе препарирования и окрашиванкя тканей нельзя использовать никакие ипструменты, содержащие железо. Мы набл1одали окращиваине селезенки голубя.

которая содержит железо, отщепившееся от гемоглобина. У пчелы (КМегЬВСЬ е~ а)., 1932), большая часть железных гранул представлена гидратом оксида железа, например в составе феррнтина. и интенсивно окрашивается. Итак„окрашкваиие ферроцианкдом калия является первым шагом при изучении жеяезо- СОДЕРжаШИХ тхаНЕй. Эта МЕтОДИКа ПОКВЗЫВВЕТ, КаКИЕ тКаин И КЛЕТКИ содержат железо, а также позволяет установить„распределено лк оно лйффузко или присутствует В виде гранул, 2.2. Электронная микроскопия 2.2.).

Общие методы Ч. 11..цфь»»»»,~ы н хн ~й~»М~ Детальное описание желсэосодержаших тканей получиюг и ультра- структурных исследованиях» которые пОзволяют классифкцарОвать жел~дасодержащие клетки и выявлять внутриклеточную локализацию железа. Цо всех случаях данные электронной микроскопии должны коррелировать с данными световой микроскопии Имея зто в виду, мы окрашивалн срезы фиксированных и закшонскяых в среду для электронной мнкраскопки тканей (Толщиной 1 мкм) Ферроцианидным методом, а затем токккс «ВОО А) срезы исследовали с помощью электроннога микрОскОпа.

Общим методом подготовки ткани для электронной микроскопии является ее фиксация 2,5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатком буфере, рН 7,4, в течение 1 ч прк комнатной температуре. В некоторых случаях, например у голубей„первичную фиксацию осуществляют путем псрфузкя фиксатором всего животного. В других случаях, например у пчел, ткань выделяют препарированкем и фиксируют погружением в среду. После первичной фиксации ткань извлекают из организма, промывают в буфере в течение ЗО мин, а затем дополнитель- ПО фиксируют в !%-ном растворе четырехоксидя асмия и фосфатпом буфере в течение 1 ч Прн аналитической электронной микроскопии обработку осмием не производят. Ткань обезвоживают проволкой через инстон и заключают в пластмассу «РО1у1зкЬ «Ро)узс1епссз) илк эпок 312, Эг»ок более предпочтителен лля аиалитическОЙ микрОскопии, но Ои малодоступен в настоящее время.

Дня обычной микроскопии пригодны любые пластмассы» имеющиеся В продаже. толсгые или тонкие срезы делают на ультрамикротоме, используя стеклянные или алмазные ножи. Если ткань особенно богата гракулими железа, предпочтительнес алмазный нож, поскОльку стеклянный быстро тупится.

Срезы помещают на шюскис медные сетки, окрашивают в течение 2О-ЗО мнн насыщенным водным раствором ураннлацетата, Промывают. а затем окрашивают в течение ! мин цнтратом свинца по Рейнольдсу, Использование солей тяжелых ьвггаллов «четырехоксида осмия, уранилацетата и цитрата свинца) необходимо для выявления клеточных деталей. Для аналитичсшой микроскопии делан~т более толстые «! 5ОО А) срезы ие обработанного осмием материала, заключеивого в эпон.

Некоторые срезы затем контрастируют ураном и свинцом лля выявления структуры клеток, ко Остальные, предназначенные для анализа„не окрашивают вообще, При наблюдении в электронный микроскоп на обычных тонких срезах хорошо видна структура клетки, Если присутствует железо, его «по крайней мере, в тех тканях, которые мы изучали) можно выявить в виде электроноплотных частиц или отложении, Часто бывает трудно Отличи и эти Отложения От другого интенсивно ОкрашеинОГО матерналВ.

.'7»жн:шуици»$ *»/эвнг:хорны»' Вкно»ниФи .)«»'.и'зн и я.иункмх Следует отмстить, что гракулы железа часто дробят и разрывают срез в процессе его изготовления. К тому же железо обычно является наиболес электроноплотным абьектом в срезе. Однако на основе одних ультра- структурных исследований нельзя провести надежную идентификацию материала.

Полезно сравнивать ультраструктурные изображения с картинами окрашиванкя, иаблюдаемымн на срезах тшо жс материала толщиной 1 мкм в световом микроскопе Залнвочные пластмассы, необходимые для электронной микроскопии, значи*сльно тверже» чем гликол-метакрилатные пластмассы» используемые для световой микроскопии. Поэтому окрашиванке электронно-микроскопических срезов толщиной ) мкм связано с трудностями, обусловленными плохим проникновением красителя.

Срезы делают иа ультрамикротоме, иа плаву наносят на прсдметныс стекла, Высушивают н обжнгикгг, подогревая стекла В тсчскис приблизительно ЗО с на пламени спиртовки. Стекла погружают ка 15 мин в горячий красящий РВСтВОР, пРамЫВВЮт ДНСтИЛЛИРОВанкой ВОДОЙ, а ЗВТЕМ ДОПОЛННтЕЛЬна Окрашивают ЭтОт процесс иожна повторять многократно, но%а кс досткгасгся удовлетворительная интенсивность окраски.

Обычно для этого достаточно двух окрашкиакий. В ~луча~ необходимости срезы можно обработать красителем Ксрнсхтрота. В результате на срезе виден ~ олубой асадОк. Важно исследовать ряд срезов для того, чтобы убедиться в устойчивости картины охраыжваннл и в том, что ока нс связана с загрязнением срсэи При подготовке срезов для эаектранной мнкросконки окраска Всегда менее интенсивна, чем в других случаях из-за очень тонких срезов и относительной жесткости пластмассы. Тем ие менее на срезе можко ясно видеть отложения железа и идентифицировать клетки, содержащие железо. Сориентировав соответствующим Образом блок с клетками» можно сделать тонкие срезы для электроннОЙ ммкросяопии.

При малом увеличении электронного микроскопа сравнивают клетки, нмсющнс злектронаплатные частицы» с клетками, дающими позитивное Окрашквание иа железо в световом микроскопе. Это весьма существенно, поскольку не все плотные частицы, видимые в электронный микроскоп, действительно содержат железо, 2.2.2. Аналитическая электронная микроскопия Чтобы однозначно установить, что злектроиоплотные частицы содержат жслезО, неОбхОдим рентгеновский микроаиализ.

Как ОтмсчалОсь выше, для этого срезы должны быть толше, чем обычные срезы для ~лектронной микроскопии, и их не следует обрабатывать осмием, свинцом или ураном. Срезы можно помещать иа станлнртныс медные сетки, хотя предпочтительнее сетки из углерода. Перед исследованием срезы должны быть покрыты спектрально-чистым углеродом. Углерод предотвращает зарядные эффекты и обеспечивает некоторую температурную стабильность. А~ализ производят на просвечивающем электронном микроскопе, снабженном нерассеиваницнм детектором и компьютерной системой. Мы использовали 3ЕОЕ 2ООС с боковым вводом гониометрнческой ступени и горизонтальным детектором.

Поскольку само оборудОвание состоит Главным образом нх железа, очень важно, чтобы рассеяние электронов н рентгеновских лучей было сведено к минимуму. Так, следует использовать жесткую диафрагму рентгеновских лучей и применять графитовый образец. Процедура анализа состОит в локализации клстОк с грануламн В неокрашенных срезах. Она облегчается введением дифракционной диафрагмы, благодаря чему повышается контраст. После локализации подходящих клеток и идентификации гранул повьппают увеличение и помещают часгицы в центре поля зрения, Фокусируют конденсорную линзу, чтобы выделить одну нз частиц, и начинают рентгеновский анализ.

Обычно мы вели ПОдсчет в течение 2ОО с и старались, чтобы «время простояь было небольшим, порядка 4 — 5%, так что детектор не был насыщен, Полученный рентгеновский спектр сохранялся на дисках компьютера вместе со спектрамк друГкх частиц. Кроме ТОГО, мы всегда произВОдили анализы участков цитоплазмы Вблизи Гранул.

Характеристики

Список файлов книги