наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты (1091952), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Включение фотосенсибилизаторов (ФС) внутрь наноструктур, например, наночастицуменьшает побочные эффекты, повышает растворимость и дисперсность гидрофобного ФС.Известно, что относительная эффективность и межклеточная локализация ФС зависит от егоструктуры, в частности, от амфифильности, типа и расположения гидрофильных игидрофобных заместителей вокруг макроцикла [210-213]. Легкодоступные синтетическиеаналоги природных ФС являются объектами многочисленных исследований [214-216].Активно исследуются гидроксизамещенные порфирины, которые являются структурнымианалогами ФС второго поколения – мезо-тетрагидроксифенилхлорина (m-THPC), клинически96используемого под названием Фоскан®.
Проблемы низкой растворимости и небольшогоклеточного поглощения порфиринового макроцикла могут быть решены введением вмакроцикл гидрофильных заместителей (гидрокси-, сульфо-, фосфатных групп, ПЭГ),присоединением пептидов, сахаров, циклодекстринов и т.д. [217,218] . В литературе [219]сообщается о возможности применения ПЭГ-производных порфиринов для леченияразличных заболеваний, в том числе для ФДТ рака. Гидрофильные полимеры на основе ПЭГпридают терапевтическому агенту пространственную стабилизацию, «невидимость» длясистемы мононуклеарных фагоцитов и опсонизирующих белков (иммуноглобулинов ифакторов комплемента), а также снижают токсичность, иммуногенность, аллергенность,увеличивают время жизни лекарств в сыворотке крови [220,221].Учитывая гидрофобный характер производных порфиринов, нами были отработаныспособы получения наночастиц на основе сферических аморфных наночастиц и мезоарилпорфиринов.
Изучены эффективность включения порфиринов в САНЧ и стабильностьпрепаратов. С этой целью были использованы ряд порфиринов I-V (рис. 68), в которыхварьироваласьстепеньгидрофобностизаместителей,атакжесимметричноеилинесимметричное расположение заместителей. Мезо-арилпорфирины были синтезированы накафедрехимииитехнологиибиологическиактивныхсоединенийимениН.А.Преображенского (Московский государственный университет тонких химических технологийим.
М.В. Ломоносова). Следует отметить, что соединения I-V не растворяются в воде,наночастицы же с включенными порфиринами водорастворимы. Кроме того, хромофорныесвойства порфиринов позволяют использовать спектрофотометрические методы для контролявключения порфиринов в САНЧ и оценки стабильность полученных препаратов.Рис. 68.
Структура исследуемых порфиринов.974.3.2. Получение нанодисперсийНанодисперсии были подготовлены на основе способности загрузки САНЧ ссинтетическими мезо-арилпорфиринами I-V. Нанодисперсии САНЧ с синтетическими мезоарилпорфиринами были получены из смесей путем смешения соответствующих растворовсинтетических мезо-арилпорфиринов в тетрагидрофуране (ТГФ) с концентрацией 1 мг/млТГФ, СТБ в ТГФ (5 мг/мл), CHS в ТГФ (1 мг/мл - в качестве стабилизирующей добавки),фосфатного буфера (10 мМ, рН 7.5).Тетрагидрофуран удалялся упариванием в ваккуме.Дисперсии концентрировали до объема 10 мл. Свойства и стабильность полученных САНЧбыли исследованы методами динамического светорассеяния, УФ-ВИД спектрофотометрии,флуоресцентной спектроскопии, cканирующей электронной микроскопии.4.3.3.
Определение размера наночастицРазмер САНЧ, модифицированных порфиринами определяли с помощью методадинамического светорассеяния. Для создания САНЧ, модифицированных порфиринами,необходимо было подобрать наилучшие с точки зрения размера частиц и стабильностисоотношения СТБ/модификатора (порфирина). Были приготовлены и исследованы 2 сериинанодисперсий САНЧ, модифицированных порфиринами: 1) при фиксировании концентрациипорфиринов 2% (0.01 мг/мл буфера) и изменении концентрации CHS 0%, 1% (0.005мг/млбуфера) и 5% (0.025мг/мл буфера) или 2) при фиксировании концентрации CHS 2% (0.01мг/мл буфера) и изменении концентрации порфиринов 0%, 5% (0.025 мг/мл буфера) и 10%(0.05 мг/мл буфера).
Концентрации порфиринов и CHS в нанодисперсиях рассчитаны поотношению к содержанию СТБ. По полученным данным в табл. 5,размеры частиц длябольшинства соединений оказались в диапазоне 100-300 нм, что отвечает требованиям приразработке безопасных нанопрепаратов. При фиксировании концентрации порфириновразмеры частиц САНЧ уменьшаются постепенно с увеличением концентрации CHS. Присамой высокой концентрации CHS 5% и концентрации порфиринов II-V, равной 2%,наночастицы имели наименьшие размеры. Во втором эксперименте при фиксированииконцентрации CHS 2%,размеры частиц увеличиваются с увеличением концентрациизагружаемых веществ и достигают наибольших размеров при концентрации порфиринов 10%.Полученные результаты представлены в таблице 5.98Таблица 5.
Размеры полученных наночастиц.2% Порфирина + При изменении CHSСоединение(I)(II)(III)(III)(IV)(V)2%CHS + При изменении порфириновДоляпорфиринов,%Доля СHS, %Размерчастиц,нм2164074081932382131660510222143246305001933270214315001500152862171931431511581931852601755102227728005102221431761600510222143152202Доляпорфиринов,%Доля (СHS), %Размерчастиц,0019322202220150015022202220222нм4.3.4. Определение дзета-потенциала (ζ)Дзета-потенциал является одиним из важных факторов, значительно влияющих наформирование САНЧ и поддержание стабильности нанодисперсий.
Поверхностный потенциалприводит к взаимному отталкиванию между соседними наночастицами и обеспечиваетпроцесс формирования наночастиц. Нанодисперсии с высоким значением дзета-потенциала(+ или -) часто более стабильны, чем наноструктуры с низким дзета-потенциалом (низкийдзета-потенциал является одной из причин, приводящих к агрегации и снижениюустойчивости).Следующим этапом работы было определение ζ-потенциала полученных дисперсий.Результаты представлены на рис. 69 и в табл.
6 Значения ζ -потенциалов нанодисперсийнаходятсяв диапазоне от - 33 до - 37 мВ.Кроме того, ζ-потенциалы нанодисперсийувеличиваются с увеличением гидрофобности порфиринов, загруженных в САНЧ (IV > II >99САНЧ(контроль) > V). Предположительно, основную роль в стабилизации дисперсий САНЧиграет кофеат бетулина, пирокатехиновые гидроксильные группы которого создаютотрицательный заряд, препятствующий агрегации наночастиц. При соответствующемзначении рН среды, отрицательно заряженные ионы кофеата бетулина (в основном OH-), какправило, диссоциируют и передвигаются к поверхности наночастиц с формированиемотрицательного потенциала слоя вокруг частиц.
Заряженные молекулы при формированииСАНЧ должны вытесняться на поверхность частиц, придавая им отрицательный заряд. Этотповерхностный заряд, в свою очередь, должен препятствовать агрегации САНЧ.Таблица 6. Дзета-потенциал исследуемых дисперсий САНЧ.Дзета-потенциал исследуемых дисперсий САНЧ (мВ)САНЧ без порфиринов и CHS-31.8САНЧ + 2% СНS и без порфиринов (Контроль)-34.58САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (II)-35.09САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (IV)-36.29САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (V)-33.78Рис. 69. Величина дзета потенциала наночастиц САНЧ, загруженных 10% порфирина V (0.05 мг/мл буфера) и2% СНS (0.01 мг/мл буфера).4.3.5. Исследование морфологии наночастицИсследование морфологии наночастиц проводилось с помощью метода cканирующейэлектронной микроскопии. На рис.
70 представлены микрофотографии наночастиц на основеСАНЧ, модифицированных порфиринами IV и V, а также контрольной дисперсии, несодержащей порфиринов. На всех микрофотографиях имеются три вида компонентов:сферические наночастицы, маленькие палочковидные кристаллы и серые области.100Наночастицы при этом имеют схожие размеры, обособлены между собой и неагрегируют.
На основании результатов, полученных при сравнении состава контрольнойнанодисперсии и дисперсий, модифицированных порфиринами IV и V с концентрацией 10%,можно считать, что серые области обусловлены присутствием CHS, а палочковидныекристаллы с маленькими размерами – остатками тритерпеноидов бересты, не образующихнаноструктуры (бетулин, лупеол). Видимые сферические везикулы – это наночастицы,образующиеся из кофеата бетулина. Таким образом, молекулы порфиринов и САНЧ образуютустойчивые сферические агломераты, однако, остается открытым вопрос о локализациимолекул порфиринов в САНЧ (внутренняя инкапсуляция или поверхностное присоединение).абвРис.
70. Электронные микрофотографии нанодисперсий САНЧ: а - нанодисперсия САНЧ с 10% порфирина V(0.05 мг/мл буфера) + 2% CHS (0.01 мг/мл буфера); б - нанодисперсия САНЧ с 10 % порфирина IV (0.05 мг/млбуфера) + 2% CHS (0.01 мг/мл буфера); в -контрольная нанодисперсия САНЧ (без порфиринов) + 2% CHS (0.01мг/мл буфера).4.3.6. Оценка возможности загрузки САНЧ с порфиринами и стабильностидисперсииНа основании полученных данных о размерах частиц и морфологии мы исследоваливозможность загрузки САНЧ с порфиринами с помощью УФ-спектроскопии и флуориметрии.Согласно полученным экспериментальным данным, амфифильные мезо-арилпорфириныхорошо связываются с наночастицами САНЧ.
С помощью исследования УФ-спектровпорфиринов I и II в нанодисперсиях САНЧ получили, что при фиксировании концентрациизагружаемых веществ 2%, увеличение концентрации CHS до 5% способствует увеличениюэффективности загрузки порфиринов в частицы. На рис. 71 показано увеличение содержанияпорфиринов I и II, загружаемых в САНЧ по увеличению величин оптической плотностивеществ в нанодисперсиях при использовании различных концентраций СНS до 5% .101баРис. 71. Увеличение содержания порфиринов I и II, загружаемых в САНЧ по увеличению величин оптическойплотности веществ в нанодисперсиях САНЧ при использовании различных концентраций СНS: а – дляпорфирина I; б - для порфирина II.Результаты флуориметрии порфиринов IV и V показывают, что при добавлениивысокойконцентрацииCHSувеличивается интенсивностьфлуоресценции,достигаянаивысшего значения при 5% CHS (рис.72б и 73б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
