Создание наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты (1091952), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Включение фотосенсибилизаторов (ФС) внутрь наноструктур, например, наночастицуменьшает побочные эффекты, повышает растворимость и дисперсность гидрофобного ФС.Известно, что относительная эффективность и межклеточная локализация ФС зависит от егоструктуры, в частности, от амфифильности, типа и расположения гидрофильных игидрофобных заместителей вокруг макроцикла [210-213]. Легкодоступные синтетическиеаналоги природных ФС являются объектами многочисленных исследований [214-216].Активно исследуются гидроксизамещенные порфирины, которые являются структурнымианалогами ФС второго поколения – мезо-тетрагидроксифенилхлорина (m-THPC), клинически96используемого под названием Фоскан®.
Проблемы низкой растворимости и небольшогоклеточного поглощения порфиринового макроцикла могут быть решены введением вмакроцикл гидрофильных заместителей (гидрокси-, сульфо-, фосфатных групп, ПЭГ),присоединением пептидов, сахаров, циклодекстринов и т.д. [217,218] . В литературе [219]сообщается о возможности применения ПЭГ-производных порфиринов для леченияразличных заболеваний, в том числе для ФДТ рака. Гидрофильные полимеры на основе ПЭГпридают терапевтическому агенту пространственную стабилизацию, «невидимость» длясистемы мононуклеарных фагоцитов и опсонизирующих белков (иммуноглобулинов ифакторов комплемента), а также снижают токсичность, иммуногенность, аллергенность,увеличивают время жизни лекарств в сыворотке крови [220,221].Учитывая гидрофобный характер производных порфиринов, нами были отработаныспособы получения наночастиц на основе сферических аморфных наночастиц и мезоарилпорфиринов.
Изучены эффективность включения порфиринов в САНЧ и стабильностьпрепаратов. С этой целью были использованы ряд порфиринов I-V (рис. 68), в которыхварьироваласьстепеньгидрофобностизаместителей,атакжесимметричноеилинесимметричное расположение заместителей. Мезо-арилпорфирины были синтезированы накафедрехимииитехнологиибиологическиактивныхсоединенийимениН.А.Преображенского (Московский государственный университет тонких химических технологийим.
М.В. Ломоносова). Следует отметить, что соединения I-V не растворяются в воде,наночастицы же с включенными порфиринами водорастворимы. Кроме того, хромофорныесвойства порфиринов позволяют использовать спектрофотометрические методы для контролявключения порфиринов в САНЧ и оценки стабильность полученных препаратов.Рис. 68.
Структура исследуемых порфиринов.974.3.2. Получение нанодисперсийНанодисперсии были подготовлены на основе способности загрузки САНЧ ссинтетическими мезо-арилпорфиринами I-V. Нанодисперсии САНЧ с синтетическими мезоарилпорфиринами были получены из смесей путем смешения соответствующих растворовсинтетических мезо-арилпорфиринов в тетрагидрофуране (ТГФ) с концентрацией 1 мг/млТГФ, СТБ в ТГФ (5 мг/мл), CHS в ТГФ (1 мг/мл - в качестве стабилизирующей добавки),фосфатного буфера (10 мМ, рН 7.5).Тетрагидрофуран удалялся упариванием в ваккуме.Дисперсии концентрировали до объема 10 мл. Свойства и стабильность полученных САНЧбыли исследованы методами динамического светорассеяния, УФ-ВИД спектрофотометрии,флуоресцентной спектроскопии, cканирующей электронной микроскопии.4.3.3.
Определение размера наночастицРазмер САНЧ, модифицированных порфиринами определяли с помощью методадинамического светорассеяния. Для создания САНЧ, модифицированных порфиринами,необходимо было подобрать наилучшие с точки зрения размера частиц и стабильностисоотношения СТБ/модификатора (порфирина). Были приготовлены и исследованы 2 сериинанодисперсий САНЧ, модифицированных порфиринами: 1) при фиксировании концентрациипорфиринов 2% (0.01 мг/мл буфера) и изменении концентрации CHS 0%, 1% (0.005мг/млбуфера) и 5% (0.025мг/мл буфера) или 2) при фиксировании концентрации CHS 2% (0.01мг/мл буфера) и изменении концентрации порфиринов 0%, 5% (0.025 мг/мл буфера) и 10%(0.05 мг/мл буфера).
Концентрации порфиринов и CHS в нанодисперсиях рассчитаны поотношению к содержанию СТБ. По полученным данным в табл. 5,размеры частиц длябольшинства соединений оказались в диапазоне 100-300 нм, что отвечает требованиям приразработке безопасных нанопрепаратов. При фиксировании концентрации порфириновразмеры частиц САНЧ уменьшаются постепенно с увеличением концентрации CHS. Присамой высокой концентрации CHS 5% и концентрации порфиринов II-V, равной 2%,наночастицы имели наименьшие размеры. Во втором эксперименте при фиксированииконцентрации CHS 2%,размеры частиц увеличиваются с увеличением концентрациизагружаемых веществ и достигают наибольших размеров при концентрации порфиринов 10%.Полученные результаты представлены в таблице 5.98Таблица 5.
Размеры полученных наночастиц.2% Порфирина + При изменении CHSСоединение(I)(II)(III)(III)(IV)(V)2%CHS + При изменении порфириновДоляпорфиринов,%Доля СHS, %Размерчастиц,нм2164074081932382131660510222143246305001933270214315001500152862171931431511581931852601755102227728005102221431761600510222143152202Доляпорфиринов,%Доля (СHS), %Размерчастиц,0019322202220150015022202220222нм4.3.4. Определение дзета-потенциала (ζ)Дзета-потенциал является одиним из важных факторов, значительно влияющих наформирование САНЧ и поддержание стабильности нанодисперсий.
Поверхностный потенциалприводит к взаимному отталкиванию между соседними наночастицами и обеспечиваетпроцесс формирования наночастиц. Нанодисперсии с высоким значением дзета-потенциала(+ или -) часто более стабильны, чем наноструктуры с низким дзета-потенциалом (низкийдзета-потенциал является одной из причин, приводящих к агрегации и снижениюустойчивости).Следующим этапом работы было определение ζ-потенциала полученных дисперсий.Результаты представлены на рис. 69 и в табл.
6 Значения ζ -потенциалов нанодисперсийнаходятсяв диапазоне от - 33 до - 37 мВ.Кроме того, ζ-потенциалы нанодисперсийувеличиваются с увеличением гидрофобности порфиринов, загруженных в САНЧ (IV > II >99САНЧ(контроль) > V). Предположительно, основную роль в стабилизации дисперсий САНЧиграет кофеат бетулина, пирокатехиновые гидроксильные группы которого создаютотрицательный заряд, препятствующий агрегации наночастиц. При соответствующемзначении рН среды, отрицательно заряженные ионы кофеата бетулина (в основном OH-), какправило, диссоциируют и передвигаются к поверхности наночастиц с формированиемотрицательного потенциала слоя вокруг частиц.
Заряженные молекулы при формированииСАНЧ должны вытесняться на поверхность частиц, придавая им отрицательный заряд. Этотповерхностный заряд, в свою очередь, должен препятствовать агрегации САНЧ.Таблица 6. Дзета-потенциал исследуемых дисперсий САНЧ.Дзета-потенциал исследуемых дисперсий САНЧ (мВ)САНЧ без порфиринов и CHS-31.8САНЧ + 2% СНS и без порфиринов (Контроль)-34.58САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (II)-35.09САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (IV)-36.29САНЧ +2% СНS + 10% порфирина (V)-33.78Рис. 69. Величина дзета потенциала наночастиц САНЧ, загруженных 10% порфирина V (0.05 мг/мл буфера) и2% СНS (0.01 мг/мл буфера).4.3.5. Исследование морфологии наночастицИсследование морфологии наночастиц проводилось с помощью метода cканирующейэлектронной микроскопии. На рис.
70 представлены микрофотографии наночастиц на основеСАНЧ, модифицированных порфиринами IV и V, а также контрольной дисперсии, несодержащей порфиринов. На всех микрофотографиях имеются три вида компонентов:сферические наночастицы, маленькие палочковидные кристаллы и серые области.100Наночастицы при этом имеют схожие размеры, обособлены между собой и неагрегируют.
На основании результатов, полученных при сравнении состава контрольнойнанодисперсии и дисперсий, модифицированных порфиринами IV и V с концентрацией 10%,можно считать, что серые области обусловлены присутствием CHS, а палочковидныекристаллы с маленькими размерами – остатками тритерпеноидов бересты, не образующихнаноструктуры (бетулин, лупеол). Видимые сферические везикулы – это наночастицы,образующиеся из кофеата бетулина. Таким образом, молекулы порфиринов и САНЧ образуютустойчивые сферические агломераты, однако, остается открытым вопрос о локализациимолекул порфиринов в САНЧ (внутренняя инкапсуляция или поверхностное присоединение).абвРис.
70. Электронные микрофотографии нанодисперсий САНЧ: а - нанодисперсия САНЧ с 10% порфирина V(0.05 мг/мл буфера) + 2% CHS (0.01 мг/мл буфера); б - нанодисперсия САНЧ с 10 % порфирина IV (0.05 мг/млбуфера) + 2% CHS (0.01 мг/мл буфера); в -контрольная нанодисперсия САНЧ (без порфиринов) + 2% CHS (0.01мг/мл буфера).4.3.6. Оценка возможности загрузки САНЧ с порфиринами и стабильностидисперсииНа основании полученных данных о размерах частиц и морфологии мы исследоваливозможность загрузки САНЧ с порфиринами с помощью УФ-спектроскопии и флуориметрии.Согласно полученным экспериментальным данным, амфифильные мезо-арилпорфириныхорошо связываются с наночастицами САНЧ.
С помощью исследования УФ-спектровпорфиринов I и II в нанодисперсиях САНЧ получили, что при фиксировании концентрациизагружаемых веществ 2%, увеличение концентрации CHS до 5% способствует увеличениюэффективности загрузки порфиринов в частицы. На рис. 71 показано увеличение содержанияпорфиринов I и II, загружаемых в САНЧ по увеличению величин оптической плотностивеществ в нанодисперсиях при использовании различных концентраций СНS до 5% .101баРис. 71. Увеличение содержания порфиринов I и II, загружаемых в САНЧ по увеличению величин оптическойплотности веществ в нанодисперсиях САНЧ при использовании различных концентраций СНS: а – дляпорфирина I; б - для порфирина II.Результаты флуориметрии порфиринов IV и V показывают, что при добавлениивысокойконцентрацииCHSувеличивается интенсивностьфлуоресценции,достигаянаивысшего значения при 5% CHS (рис.72б и 73б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
