Автореферат (1091620), страница 4
Текст из файла (страница 4)
erythropolis S67, выращенных на гексадеканеКак видно на фотографиях ультратонких срезов клеток (рисунок 4),цитоплазматическая мембрана (ЦМ) бактерий Rhodococcus имеет электроннопрозрачный слой. Снаружи к ЦМ прилегает клеточная стенка (КС), типичная поультраструктуре для грамположительных бактерий: чаще всего она имеет видплотного гомогенного слоя толщиной 20–30 нм. Наружная поверхность клеточнойстенки покрыта тонким слоем микрофибриллярной капсулы и различнымиповерхностными и внеклеточными ультраструктурами с характерной гранулярнофибриллярной или везикулярной организацией (ВПС), которые имеют высокоесродство к рутению красному. В цитоплазме встречаются электронно-прозрачныевключения (В), характерные для веществ гидрофобной природы (рисунок 4в, 4б).Рисунок 4. Ультратонкие срезы клеток (условия культивирования бактерий: 2% гексадекан;10оС; 6 суток): а, б - R.
erythropolis S67; в, г - R. erythropolis X5. Виднывнутрицитоплазматические мембраноподобные структуры различной упаковки. КС клеточная стенка; ММС - внутрицитоплазматические мультимембранные структуры; ЦМ цитоплазматическая мембрана; В – липидные включения; ВПС- внеклеточныеповерхностные структуры. Длина масштабной метки - 0.2 мкм.14Включения сферической формы, мелкие или среднего размера. Число включенийна срез клетки колеблется от 0–1 до 3–4.
Мы предполагаем, что включенияпредставляют собой триацилглицериды в окружении полярных липидов. Этоподтверждается данными о низком содержании н-гексадекана и высоком содержаниижирных кислот в составе клеточных липидов (п.3.2.1). На ультратонких срезахобнаруживаются мультимембранные структуры (ММС) преимущественно в видемножественных, уложенных параллельно друг другумембраноподобных петлевидных или трубчатыхобразований, как правило, связанные с гидрофобнымивключениями (рисунок 4б, 4г). Профиль ММСсостоит из нескольких электронно-плотных слоев(аналоггидрофильныхслоевбиологическихмембран), чередующихся с электронно-прозрачнымислоями (аналог гидрофобных зон биологическихмембран) (рисунок 4).
Подобные структуры ранеебыли обнаружены у Sulfobacillus в период адаптацииих к низким температурам (Сузина с соав.,1999),Pseudomonas,способныхутилизироватьдодецилсульфат натрия (Сузина с соав., 1988) иAcinetobacter sp., выращенных на углеводородах(Scott et al. 1976). Предположительно, ММСучаствуют в транспорте гидрофобного субстрата вклетку, при этом, возможно, происходит егоокисление до гексадекановой кислоты под действиеммембранлокализованныхферментов.Обэтомкосвенно свидетельствует наличие гексадекановойкислоты в культуральной среде бактерий (п.3.2.2).При температуре 26оС через 6 сутоккультивированияобнаруживаетсямноголизированныхклеток;вклеткахбактерийнаблюдаются крупные включения, как правило, Рисунок 5. Ультратонкиесрезы культуральной среды сединичные, часто полигональной формы с резко клетками R.
erythropolis S67очерченными острыми углами и контурами. ММС (условиякультивированиябактерий:2%гексадекан;10 оС;слабо развиты и четко видны только в области6 суток): Видны везикулы (ВЗ),ограничительного контура включений.окруженные оболочкой изВблизи поверхности и непосредственно на электронно-плотныхслоев,поверхности клеток выявляются множественные связанные с клетками бактерийпомощьюэлектронногранулы сферической формы с гомогенным сплотных фибр (Ф).
Длинасодержимым, иногда имеющие сходство с везикулами, масштабной метки - 0.1 мкмт.е. окруженные трехслойной мембраной (рисунок 5).15Наружная поверхность этих образований покрыта тонким рыхлым слоем с высокойэлектронной плотностью. Эти везикулярные образования могут представлять собойдепо гидрофобного субстрата – гексадекана, в виде крупных мицеллярных структур. Наультратонких срезах обнаружены электронно-плотные нити (фибриллоподобныеструктуры, Ф), которые окружают и соединяют везикулы с поверхностью клетки.Подобные структуры наблюдали Уайт с соавт.
при изучении физиологическойадаптации родококков, способных расти на гексадекане при 5оС (White et al., 1999). Мыпредполагаем, что внеклеточные биосурфактанты образуют гидрофобные каналы,связывающие липидные везикулы с клеточной стенкой бактерий и способствующиепоступлению гексадекана в клетки бактерий.
Следует отметить, что отрицательнозаряженные сукцинилтрегалолипиды, в состав которых входит остаток янтарнойкислоты, могут проявлять высокое сродство к положительно заряженному рутениевомукрасному, что, возможно, и приводит к появлению электронно-плотных структур вобласти их локализации.3.4Химическаяструктураихарактеристикабиосурфактантов, продуцируемых бактериями при 10оСгликолипидных3.4.1 Качественная характеристика внеклеточных гликолипидов бактерийДля обнаружения гликолипидов, продуцируемых бактериями в культуральнуюсреду при росте на гексадекане, липидный экстракт из бесклеточного супернатантаанализировали методом тонкослойной хроматографии с α-нафтольным реагентом. Нахроматограммах наблюдается 5–6 основных гликолипидных компонентов и многоминорных соединений с одинаковой хроматографической подвижностью для всеханализируемых образцов (рисунок 6).Рисунок 6.
Хроматограмма липидных экстрактов, выделенных из среды штаммов X5 (а) и S67(б) при росте на н-гексадекане (26оС и 10оС).16На хроматограммах липидных экстрактов из среды бактерий Х5, выращенныхпри 26оС и 10оС, наблюдается пять основных сигналов с Rf 0.35, 0.40, 0.45, 0.54, 0.64(рисунок 6а). В то время как на хроматограмме образца из среды штамма S67,выращенного при пониженной температуре, проявляется дополнительный сигнал болееподвижного компонента с Rf6 0.76 (рисунок 6б). Таким образом, бактерии R. erythropolisX5 и R. erythropolis S67 способны продуцировать гликолипиды в культуральную средупри пониженной температуре (10оС). Однако при этой температуре культивированияизменяется соотношение гликолипидных компонентов: интенсивность окраски болееподвижных компонентов возрастает, а менее подвижных – уменьшается.3.4.2Структураосновноговнеклеточных гликолипидовРисунок 7.
Масс-спектры главногогликолипидного компонентакомпонентаМетодомпрепаративнойколоночнойхроматографиивыделилииндивидуальныйкомпонент с Rf 0.35 из всех образцов липидныхэкстрактов. Определение структуры соединенийпроводили с помощью масс-спектрометрии вусловиях регистрации положительных ионов. В массспектрах очищенных образцов, полученных при 26 С(рисунок 7), присутствуют те же сигналы, что и дляобразцов, полученных при 10 С: три сигналанатриевых аддуктов [M+Na]+ с m/z 871, m/z 899 и m/z927, которые соответствуют молекулярным массам848, 876 и 904 Да. Поскольку разница в массах междусоседними сигналами составляет 28 Да, можнопредположить, что эти три вещества являютсягомологами. Интенсивность пика m/z 899 почти в 2.5раза и 10 раз больше, чем интенсивность сигналов m/z871 и m/z 927 соответственно.Фрагментация каждого из ионов [M+Na]+ с m/z871 и m/z 899 давала идентичную картину дляобразцов, полученных при двух температурахкультивирования (рисунок 8).17Рисунок 8.
Фрагментация в положении иона [M+Na]+ с m/z 899Это свидетельствует об одинаковой структуре основного гликолипида,продуцируемого R. erythropolis S67 при температурах 26оС и 10оС. В МС/МС спектренатриевого аддукта [M+Na]+ с m/z 899 наблюдаются пики c m/z 799, m/z 781, m/z 755,m/z 727, которые соответствуют соединениям, образовавшимся путем отщепленияфрагментов ангидрида янтарной кислоты (-100 Да), янтарной (-118 Да), октановой (-144Да) и декановой кислот (-172 Да), соответственно (рисунок 8). Ион с m/z 583соответствует соединению, образованному после отрыва гликозидной связи втрегалолипиде, в результате чего отщепляется фрагмент ангидрида глюкозы,ацилированной декановой кислотой (-316 Да). Это предполагает наличие у одногоглюкопиранозного кольца единственного остатка декановой кислоты, а у второго - поодному остатку янтарной, октановой и декановой кислоты.
В результате фрагментациииона [M+Na]+ с m/z 871 в спектре МС/МС появились пики с m/z 771, m/z 753, m/z 727,m/z 699, которые образовались путем отщепления тех же фрагментов, что и при распадемолекулярного иона с m/z 899 (данные представлены в диссертации). Однако вместопика с m/z 583 появился пик с m/z 555, который соответствует глюкопиранозе,ацилированной янтарной и двумя октановыми кислотами. Это подтверждает нашепредположение о том, что оба трегалолипида являются гомологами. Таким образом,основными гликолипидными биосурфактантами, продуцируемыми бактериямиR. erythropolis X5 и R.
erythropolis S67, выращенными на н-гексадекане, как при 26оС,так и при 10оС, являются 2,3,4-сукцинил-октаноил-деканоил-2'-деканоилтрегалоза и2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2'-деканоилтрегалоза. Два остальных сигнала m/z 843, m/z927 обладают незначительной интенсивностью, и их фрагментацию не проводили.Однако, по аналогии с предыдущим анализом можно заключить, что ион [M+Na]+ с m/z843 и m/z 927 соответствуют тетраэфиру трегалозы с тремя остатками октановой18кислоты – 2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2'-октаноилтрегалозе и с тремя остаткамидекановой кислоты – 2,3,4-сукцинил-дидеканоил-2'-деканоилтрегалозе.Жирнокислотный состав сукцинилтрегалолипидов подтвердили методом газовойхроматографии после метанолиза исходного гликолипида, содержание декановойкислоты составило 72%, а октановой кислоты – 28%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
