Автореферат (1091620), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Список литературы включает _176_источников, из них _12_ на русском и _164_ на английском языках.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении представлена общая характеристика диссертационной работы,изложена актуальность темы, научная новизна, теоретическая и практическаязначимость работы, сформулированы цели и задачи исследования.Глава 1. В первой главе диссертации проанализирована и обобщена информацияпо теме исследования. В первой части обзора литературы изложены общиепредставления о поверхностно-активных веществах микробного происхождения(биоПАВ, биосурфактанты), дана их классификация и основные характеристики. Вовторой части литературного обзора суммирована информация о трегалолипидныхбиосурфактантах, их свойствах и продуцентах, описаны условия культивирования,источникиэнергии,физиологическаярольибиологическаяактивностьбиосурфактантов, особое внимание уделено применению биосурфактантов, в том числе,в биоремедиации загрязненных сайтов.
В третьей части описаны методы выделениябиосурфактантов, изучения их строения и физико-химических свойств.Глава 2. Во второй главе подробно описаны объекты, материалы и методыисследования.Объекты исследования. В работе использованы штаммы R.erythropolis X5 иR.erythropolis S67 из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмидИБФМ РАН, которые депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г.Пущино) под номерами ВКМ Ас-2532Д и ВКМ Ас-2532Д, соответственно. Бактериивходят в состав биопрепарата «МикроБак» для биоремедиации нефтезагрязненныхтерриторий (Filonov et al., 2012) и любезно предоставлены для работы вед.н.с.лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, д.б.н.
Филоновым А.Е.Среды культивирования. В качестве минеральной среды для культивированиятермотолерантных нефтеокисляющих микроорганизмов использовали среду Эванса(Evans et al., 1970), в качестве полноценной – среду Лурия-Бертани (ЛБ) (Carhart, 1975).Условия культивирования. Бактерии культивировали в колбах Эрленмейера с 200мл жидкой минимальной среды Эванса и 2% (об/об) источника углерода (н6гексадекана).
Колбы инокулировали клеточной суспензией с посевной дозой 10 5–106КОЕ/мл. Микроорганизмы культивировали при температурах 10оС, 26оС в орбитальной(160–180 об/мин) качалке Excella E25 (Eppendorf, Германия) в течение 1–20 суток взависимости от цели эксперимента.Ростмикроорганизмовипродуцированиебиосурфактантов.Ростмикроорганизмов определяли по изменению оптической плотности (ОП600нм).Поверхностное натяжение бесклеточной среды измеряли на тензиометре Kruss K6(Kruss, Германия) методом отрыва кольца Дю Нуи при температуре 25°С (Bodour et al.,1998). Содержание гликолипидного биосурфактанта оценивали по концентрацииуглеводов в бесклеточном супернатанте колориметрическим методом послевзаимодействия с фенольным реактивом (Dubois et al., 1956).
Бесклеточную среду(бесклеточный супернатант) получали центрифугированием культуральной среды нацентрифуге TG16WS («Поликом», Россия) при 10 000 g в течение 10мин. Индексэмульгирования определяли по методике (Cooper et al., 1987) через 1 (Е1) и 24 часа (Е24)и рассчитывали по формуле:Экстракция, очистка и разделение гликолипидных биоПАВ. Микроорганизмыкультивировали в колбах с жидкой минимальной средой Эванса и 2% (об/об)гексадекана в течение 6 и 12 суток при 26оС и 10оС, соответственно. Клетки отделялицентрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин на центрифуге TG16WS (Поликом,Россия), рН бесклеточной среды доводили до значения 2–4 концентрированной солянойкислотой, после чего раствор выдерживали 14–18 часов при температуре 4°C.Биосурфактанты экстрагировали смесью хлороформ–метанол (3:1) из равного объемапробы.
Органический слой отбирали, растворитель удаляли на роторном испарителе(35°С, 0.2 атм). Гликолипиды охарактеризовали методом тонкослойной хроматографии(ТСХ) на хроматографических пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия). Гликолипидыэлюировали смесью хлороформ–метанол–вода (65:15:2). Для обнаружениягликолипидов пластины обрабатывали сначала нафтольным реагентом (0.5 г α-нафтолав 100 мл смеси метанол–вода 1:1), затем 10% серной кислотой и нагревали до 110°С допроявления окраски (Кирхнер, 1981). Гликолипиды проявлялись в виде бурофиолетовых пятен. Разделение липидных компонентов проводили с помощьюпрепаративной хроматографической колонки (20 см x 1 см) с силикагелем Kiesegel 60(Merck) по методике (Smyth et al., 2014).
Гликолипиды в элюируемых фракцияхобнаруживали методом ТСХ, как описано выше.Идентификация трегалолипидов методом тандемной масс-спектрометрии.Структуру гликолипида идентифицировали методом масс-спектрометрии на массспектрометре Orbitrap Elite ETD (Thermo Scientific, Германия). Масс-спектрометрию сионизацией электрораспылением (ESI-MS) проводили в режиме положительныхзарядов, и полный масс-спектр сканировали от m/z 100 по m/z 2000. Тандемную масс7спектрометрию (МС/МС) проводили в положении иона-предшественника с m/z 899, m/z871. МС/МС сканировали в интервале от m/z 50 по m/z 1500.Выделение клеточных липидов, в том числе связанного гексадекана.
Суммарныеклеточные липиды экстрагировали полярными органическими растворителями извлажной биомассы бактерий после удаления из биомассы гексадекана гексаном исмесью дихлорметана с изобутанолом согласно методике (Bligh and Dyer, 1959).Содержание связанного гексадекана определяли методом газо-жидкостнойхроматографии на хроматографе «Кристалл-5000» (Хроматек-Аналитик, Россия) скапиллярной колонкой BP1J08 (30 м 0.3 мм 0.53 мкм).Жирнокислотныйсоставклеточныхлипидовитрегалолипидныхбиосурфактантов. Жирнокислотный состав липидов определяли методом газовойхроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
Для этого проводилипереэстерификацию эфиров жирных кислот метанолом по методике (Tokumoto et al.,2009). Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) анализировали с помощьюхроматографа Agilent 6890N (Agilent Technologies Inc., США) с массспектрометрическим детектором Agilent 5973 на капиллярной колонке XP-1 (30 м x 25мм x 25 мкм). МЭЖК идентифицировали по базе данных NIST/EPA/NIH(http://www.nist.gov/srd/nist1a.cfm).Физико-химические свойства трегалолипидных биосурфактантов.
Физикохимические свойства биосурфактантов определяли по следующим показателям сиспользованием известных методик: критическая концентрация мицеллообразования(ККМ) (White et al., 2013); гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) (Marques et al.,2009); поверхностная адсорбция (Г); свободная энергия мицеллообразования (∆G);минимальная площадь молекулярной области, соответствующая насыщенныммонослоям биосурфактанта на границе вода-воздух (Smin) (Soultani et al., 2005).Степень биодеградации гексадекана бактериями. Бактерии культивировали впробирках с 10 мл жидкой среды Эванса и 2% (об/об) источника углерода (нгексадекана). Степень деградация гексадекана бактериями определяли по убылисубстрата в среде через 3, 6, 8 суток при 26оС и 6, 12, 18 суток при 10оС.
Для этого извсего объема культуральной среды экстрагировали гексадекан равным объемом гексана(10 мл) и определяли содержание н-гексадекана с помощью газового хроматографа«Кристалл-5000» (Хроматек-Аналитик, Россия) с капиллярной колонкой BP1J08 (30 м0.3 мм 0.53 мкм).Трансмиссионная электронная микроскопия клеток бактерий. Клетки бактерийфиксировали в 1.5%-ном растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере(рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч, трижды отмывали в том же буфере и дополнительнофиксировали в 1%-ном растворе OsO4 в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение3 ч при 20°С.
После обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолу Epon-812.Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки и контрастировали в течение 308мин в 3%-ном растворе уранилацетата в 70%-ном спирте и дополнительно окрашивалицитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds E.S., 1963).Обработка результатов. Математическую обработку экспериментальныхданных проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot 12.0 и Excel 2016.Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и ихобсуждение3.1 Влияние температуры на способность родококков-нефтедеструкторовпродуцировать биосурфактанты3.1.1 Продукция биосурфактантовВ ходе культивирования бактерий на гексадекане при 26оС наблюдали резкоеснижение поверхностного натяжения бесклеточного супернатанта с 72 мН/м до 27 мН/м(рисунок 1а, в-кривая 3) в конце экспоненциальной фазы – начале стационарной фазыроста для обоих штаммов родококков (рисунок 1а, в-кривая 1).
Следует отметить, чтофизиологическое поведение двух штаммов бактерий различно. Бактерии R. erythropolisX5 представляют собой планктонную культуру на всех фазах роста, в то время как,R. erythropolis S67 формируют слой биомассы на поверхности культуральной среды.Рисунок 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
